Räumliches Epigenom

Nature Band 616, Seiten 113–122 (2023)Diesen Artikel zitieren

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Neue räumliche Technologien, einschließlich räumlicher Transkriptomik und räumlicher Epigenomik, werden zu leistungsstarken Werkzeugen für die Profilierung zellulärer Zustände im Gewebekontext1,2,3,4,5. Aktuelle Methoden erfassen jedoch jeweils nur eine Ebene von Omics-Informationen, was die Möglichkeit ausschließt, die mechanistische Beziehung im zentralen Dogma der Molekularbiologie zu untersuchen. Hier stellen wir zwei Technologien für die ortsaufgelöste, genomweite, gemeinsame Profilierung des Epigenoms und Transkriptoms vor, indem wir die Zugänglichkeit des Chromatins und die Genexpression oder Histonmodifikationen (H3K27me3, H3K27ac oder H3K4me3) und die Genexpression auf demselben Gewebeabschnitt bei nahezu Einzelzellenauflösung. Diese wurden auf das Gehirn embryonaler und juveniler Mäuse sowie auf das Gehirn erwachsener Menschen angewendet, um abzubilden, wie epigenetische Mechanismen den Transkriptionsphänotyp und die Zelldynamik im Gewebe steuern. Obwohl hochkonkordante Gewebemerkmale entweder durch räumliches Epigenom oder räumliches Transkriptom identifiziert wurden, beobachteten wir auch unterschiedliche Muster, was auf ihre unterschiedliche Rolle bei der Definition von Zellzuständen schließen lässt. Durch die pixelweise Verknüpfung von Epigenom und Transkriptom können neue Erkenntnisse über räumliches epigenetisches Priming, Differenzierung und Genregulation innerhalb der Gewebearchitektur gewonnen werden. Diese Technologien sind in den Biowissenschaften und der biomedizinischen Forschung von großem Interesse.

Einzelzell-Multiomics ermöglichen die Aufdeckung der Mechanismen der Genregulation über verschiedene Omics-Schichten hinweg6,7,8,9, es fehlen jedoch räumliche Informationen, die für das Verständnis der Zellfunktion im Gewebe von entscheidender Bedeutung sind. Vor Kurzem sind räumliche Epigenomik, Transkriptomik und Proteomik entstanden1,2,3,4,5, aber die meisten davon können nur eine Schicht der Omics-Informationen erfassen. Obwohl rechnerische Methoden Daten aus mehreren Omics-Schichten integrieren können10, können sie die mechanistischen Verbindungen zwischen verschiedenen Omics-Schichten nicht ohne weiteres aufdecken. Zuvor haben wir deterministische Barcodes in Gewebe für die räumliche Omics-Sequenzierung zur räumlich aufgelösten Komessung des Transkriptoms und einer Gruppe von Proteinen entwickelt1, und kürzlich wurde es auch in der 10X-Visium-Plattform11 realisiert. Um die epigenetischen Mechanismen, die der Genexpressionsregulation zugrunde liegen, weiter zu untersuchen, haben wir hier eine räumlich aufgelöste, genomweite Komparierung des Epigenoms und des Transkriptoms durch gleichzeitige Profilierung der Chromatinzugänglichkeit und der Messenger-RNA-Expression entwickelt (räumlicher Assay für Transposase-zugängliches Chromatin und RNA mittels Sequenzierung ( räumliche ATAC-RNA-seq)) oder Histonmodifikationen und mRNA-Expression (räumlicher Assay der Spaltung unter Zielen und Tagmentierung und RNA unter Verwendung von Sequenzierung (räumliche CUT&Tag-RNA-seq); angewendet auf H3K27me3-, H3K27ac- oder H3K4me3-Histonmodifikationen) auf demselben Gewebeschnitt auf zellulärer Ebene über deterministisches Cobarcoding, um die Chemie von Spatial-ATAC-seq3 oder Spatial-CUT&Tag2 mit der für räumliche Transkriptomik zu integrieren. Wir haben diese Techniken auf das Gehirn embryonaler und jugendlicher Mäuse sowie auf den Hippocampus des erwachsenen menschlichen Gehirns angewendet, um epigenetische und transkriptionelle Zustände und ihre Rolle bei der Regulierung der Zelltypdynamik im Gewebe zu analysieren. Diese Arbeit eröffnet neue Grenzen in der räumlichen Omics und könnte beispiellose Möglichkeiten für die biologische und biomedizinische Forschung bieten.

Die räumliche ATAC-RNA-Sequenz ist schematisch in Abb. 1a und den erweiterten Daten in Abb. 1a – c dargestellt. Ein gefrorener Gewebeschnitt wurde mit Formaldehyd fixiert und mit einem Tn5-Transpositionskomplex behandelt, der mit einem DNA-Adapter vorbeladen war, der einen universellen Ligationslinker enthielt, der in Transposase-zugängliche genomische DNA-Loci eingefügt werden kann. Der gleiche Gewebeabschnitt wurde dann mit einem biotinylierten DNA-Adapter inkubiert, der einen universellen Ligationslinker und eine Poly-T-Sequenz enthielt, die an die Poly-A-Spur von mRNAs bindet, um die reverse Transkription (RT) im Gewebe zu initiieren. Anschließend wurde ein Mikrofluidik-Kanal-Array-Chip auf dem Gewebeschnitt platziert, um räumliche Barcodes Ai (i = 1–50 oder 100) einzuführen, die über eine templatgesteuerte Ligation kovalent an den universellen Ligationslinker konjugiert wurden. Als nächstes wurde ein weiterer Mikrochip mit Mikrokanälen senkrecht zur ersten Flussrichtung verwendet, um räumliche Barcodes Bj (j = 1−50 oder 100) einzuführen, die dann mit den Barcodes Ai (i = 1−50 oder 100) ligiert wurden, was zu einem zwei- Dimensionsgitter aus räumlich mit Barcodes versehenen Gewebepixeln, die jeweils durch die eindeutige Kombination der Barcodes Ai und Bj definiert sind (i = 1−50 oder 100, j = 1−50 oder 100; Barcodepixel, n = 2.500 oder 10.000). Schließlich wurden barcodierte komplementäre DNA- und genomische DNA-Fragmente nach der umgekehrten Vernetzung freigesetzt. cDNAs wurden mit Streptavidin-Kügelchen angereichert und gDNA-Fragmente wurden im Überstand zurückgehalten. Die gDNA- und cDNA-Bibliotheken wurden getrennt für Next-Generation-Sequencing (NGS) erstellt. Die räumliche CUT&Tag-RNA-Seq wurde durchgeführt, indem ein Antikörper gegen eine spezifische Histonmodifikation (H3K27me3, H3K27ac oder H3K4me3) auf den Gewebeschnitt aufgetragen wurde und dann ein Protein A-gebundener Tn5-DNA-Komplex zur Durchführung von CUT&Tag verwendet wurde. Die verbleibenden Schritte ähnelten denen für die räumliche ATAC-RNA-Sequenz (Abb. 1a und erweiterte Daten Abb. 1a, d, e), führten jedoch zu einer räumlichen Co-Profilierung der genomweiten Histonmodifikationsbelegung und des Transkriptoms.

a, Schematischer Arbeitsablauf. b, Vergleich der Anzahl eindeutiger Fragmente und des Anteils der Reads in Peaks (FRiP) in der räumlichen ATAC-RNA-Sequenz und der räumlichen CUT&Tag-RNA-Sequenz. c, Verteilung der Gen- und UMI-Anzahl in der räumlichen ATAC-RNA-Sequenz und der räumlichen CUT&Tag-RNA-Sequenz. Anzahl der Pixel in E13: 2.187; im menschlichen Gehirn 2.500; im Mäusegehirn (ATAC): 9.215; im Mäusegehirn (H3K27me3): 9.752; im Gehirn von Mäusen (H3K27ac): 9.370; im Gehirn von Mäusen (H3K4me3): 9.548. Boxplots zeigen den Median (Mittellinie), das erste und dritte Quartil (Boxgrenzen) und den 1,5-fachen Interquartilbereich (Whisker). d, Räumliche Verteilung und UMAP aller Cluster für ATAC, RNA und gemeinsames Clustering von ATAC- und RNA-Daten. Die Überlagerung der Cluster mit dem Gewebebild zeigt, dass räumliche Cluster genau den anatomischen Regionen entsprechen. Pixelgröße: 50 µm; Maßstabsbalken, 1 mm. e, Räumliche Kartierung von GAS und Genexpression für ausgewählte Markergene in verschiedenen Clustern für ATAC und RNA in räumlicher ATAC-RNA-Sequenz. f, Pseudozeitanalyse von radialer Glia bis zu postmitotischen vorzeitigen Neuronen, visualisiert auf räumlicher Ebene. g, Heatmaps, die die Genexpression und GAS für Markergene darstellen. h, Dynamische Veränderungen des GAS und der Genexpression über Pseudozeit hinweg.

Wir führten räumliche ATAC-RNA-seq-Experimente am embryonalen Mausembryo vom 13. Tag (E13) (Pixelgröße: 50 μm), am postnatalen Mausgehirn vom 21./22. Tag (P21/22) (Pixelgröße: 20 μm) und am Hippocampus des erwachsenen menschlichen Gehirns durch Gewebe (Pixelgröße, 50 μm). Für die Pixelgröße von 50 μm erhielten wir durchschnittlich 25 Zellen für den E10-Mausembryo1 und zwischen einer und neun Zellen für den menschlichen Hippocampus3. Die meisten 20-μm-Pixel enthielten ein bis drei Zellen pro Pixel im Gehirn jugendlicher Mäuse (ergänzende Abbildung 1b). Unter Verwendung eines 100 × 100-Barcode-Schemas deckt der Kartierungsbereich nahezu die gesamte Hemisphäre eines koronalen Abschnitts des Gehirns einer P22-Maus ab. Aus dieser Probe erhielten wir einen Median von 14.284 eindeutigen Fragmenten pro Pixel, von denen 19 % in den Regionen der Transkriptionsstartstelle angereichert waren und 26 % in Peaks lagen (Abb. 1b und ergänzende Abb. 1a und 2a). Für den RNA-Anteil wurden insgesamt 22.914 Gene nachgewiesen, mit einem Durchschnitt von 1.073 Genen und 2.358 eindeutigen molekularen Identifikatoren (UMIs) pro Pixel (räumliche ATAC-RNA-seq) (Abb. 1c). Wir führten eine räumliche CUT&Tag-RNA-Seq für H3K27me3, H3K27ac und H3K4me3 an Maus-P21/22-Gehirnen durch (Pixelgröße, 20 μm). Mit dem 100 × 100-Barcode-Gerät erhielten wir einen Median von 10.644 (H3K27me3), 10.002 (H3K27ac) und 2.507 (H3K4me3) eindeutigen Fragmenten pro Pixel, davon 12 % (H3K27me3), 17 % (H3K27ac) und 67 % (H3K4me3). überlappten sich mit den Regionen der Transkriptionsstartstelle und 12 % (H3K27me3), 21 % (H3K27ac) bzw. 54 % (H3K4me3) befanden sich in Peaks (Abb. 1b und ergänzende Abb. 1a und 2a). Für die RNA-Daten wurden 25.881 (H3K27me3), 23.415 (H3K27ac) und 22.731 (H3K4me3) Gene mit einem Durchschnitt von 2.011 (H3K27me3), 1.513 (H3K27ac) und 1.329 (H3K4me3) Genen pro Pixel (4.734 (H3K27me)) nachgewiesen 3), 3.580 (H3K27ac) bzw. 2.885 (H3K4me3) UMIs pro Pixel (Abb. 1c)). Die Bewertung der Datenqualität für Mausembryo-, P21-Mausgehirn- und menschliche Gehirnproben mit 50 × 50-Barcodes ist auch in Abb. 1b, c und den ergänzenden Abbildungen enthalten. 1a und 2a–c und Ergänzungstabellen 2 und 3.

Darüber hinaus stimmten die Insertgrößenverteilungen der Chromatinzugänglichkeit (räumliche ATAC-RNA-seq) und Histonmodifikationsfragmente (räumliche CUT&Tag-RNA-seq, H3K27me3, H3K27ac oder H3K4me3) mit den eingefangenen nukleosomalen Fragmenten in allen Geweben überein (ergänzende Abbildung 1c). ,D). Die Korrelationsanalyse zwischen Replikaten zeigte eine hohe Reproduzierbarkeit (r = 0,98 für ATAC, r = 0,98 für RNA in räumlicher ATAC-RNA-Sequenz, r = 0,96 für CUT&Tag (H3K27ac), r = 0,89 für RNA in räumlicher CUT&Tag-RNA-Sequenz; r bezeichnet den Pearson-Korrelationskoeffizienten; ergänzende Abbildung 2d, e). Gewebetyp, Vorbereitung und Qualität können alle analytische Metriken (Methoden) beeinflussen.

Die räumliche ATAC-RNA-Sequenz am E13-Mäusembryo identifizierte acht Haupt-ATAC-Cluster und 14 RNA-Cluster, was darauf hindeutet, dass die Zugänglichkeit des Chromatins in diesem Entwicklungsstadium möglicherweise nicht die Unterscheidung aller durch Transkriptionsprofile definierten Zelltypen ermöglicht. Die räumliche Verteilung dieser Cluster stimmt mit der Gewebehistologie überein (siehe Hämatoxylin- und Eosin-Färbung eines angrenzenden Gewebeabschnitts in Abb. 1d und Erweiterte Daten Abb. 2a). In den ATAC-Daten stellt Cluster A3 das embryonale Augenfeld mit offener Chromatinzugänglichkeit an den Genorten einschließlich Six6 dar (Abb. 1d (links) und Abb. 1e). Die Cluster A4–A5 sind mit mehreren sich entwickelnden inneren Organen verbunden. Die Cluster A6–A7 decken das Zentralnervensystem (ZNS) ab. Um das ATAC-Ergebnis zu vergleichen, haben wir die Chromatin-Zugänglichkeitsprofile in Pixeln innerhalb bestimmter Organe aggregiert und diese mit organspezifischen ENCODE E13.5 ATAC-seq-Referenzdaten verglichen (ergänzende Abbildung 3b). Darüber hinaus stimmen die aus unseren räumlichen ATAC-Daten erhaltenen Peaks auch mit der ENCODE-Referenz überein (ergänzende Abbildung 3c). Wir haben räumliche ATAC-Daten mit Einzelzell-RNA-seq12-Daten für die Zelltypzuordnung in jedem Cluster integriert (Erweiterte Daten, Abb. 2c, d). Wie erwartet wurden radiale Gliazellen (neuronale Stamm-/Vorläuferzellen) überwiegend in der Ventrikelschicht beobachtet, und differenzierte Zelltypen wie postmitotische vorzeitige Neuronen und inhibitorische Interneurone wurden in den von der Ventrikelschicht entfernten Regionen angereichert (Extended Data, Abb. 2d).

Zelltypspezifische Markergene wurden für einzelne Cluster identifiziert und ihre Expression aus der Zugänglichkeit des Chromatins abgeleitet (Abb. 1e und erweiterte Daten Abb. 2b, e) und anhand des Genaktivitäts-Scores (GAS13; Methoden) vorhergesagt. Sox2, das an der Entwicklung von Nervengewebe und der Bildung des Sehnervs beteiligt ist14,15, zeigte eine hohe Chromatinzugänglichkeit im embryonalen Augenfeld und in der ventrikulären Schicht, die neurale Stamm-/Vorläuferzellen enthält. Pax6 zeigte ein ähnliches räumliches Muster der Zugänglichkeit von Chromatin. Myt1l, das für das Myelin-Transkriptionsfaktor-1-ähnliche Protein kodiert, zeigte ein höheres ATAC-Signal im embryonalen Gehirn und im Neuralrohr16. Six6, ein Schlüsselgen, das an der Augenentwicklung beteiligt ist17, zeigte die höchste GAS in der Augenregion. Nrxn2, das Neurexin 2 kodiert, ein Schlüsselgen im Nervensystem von Wirbeltieren18, war in den meisten neuralen Zellregionen weitgehend zugänglich. Die Zugänglichkeit bei Rbfox3, das für das RNA-Bindungsprotein Fox-1-Homolog 3 (ein Spleißfaktor namens NeuN) kodiert, wurde in Neuronen beobachtet, während Sox1 und Sox2 eine angereicherte Chromatinzugänglichkeit in der ventrikulären Schicht aufwiesen (Abb. 1e und erweiterte Daten Abb. 2b). ). Die zelltypspezifische Anreicherung von Transkriptionsfaktor (TF)-Regulatoren wurde auch mithilfe der ChromVAR20-Analyse der Abweichung in TF-Motiven (Sox2 und Nfix) untersucht und die positiven TF-Regulatoren identifiziert (Extended Data, Abb. 2g, h). Wir beobachteten, dass das Sox2-Motiv im Cluster A7 angereichert war, was mit seiner Funktion bei der embryonalen Gehirnentwicklung übereinstimmt21. Die GREAT-Analyse22 bestätigte außerdem die starke Übereinstimmung zwischen Genregulationswegen und anatomischer Annotation (Extended Data Abb. 2i,j).

Für die räumlichen RNA-Daten wurden 14 verschiedene Cluster identifiziert und durch spezifische Markergene charakterisiert (Abb. 1d (Mitte) und erweiterte Daten Abb. 2f). Beispielsweise wurde Cluster R10 (Six6) mit dem embryonalen Auge korreliert, die Cluster R2, R6 und R8 mit dem ZNS und Cluster R7 mit der Knorpelbildung. Zur Bewertung der Datenqualität führten wir eine Korrelationsanalyse mit organspezifischen ENCODE E13.5-RNA-seq-Referenzdaten durch, die eine hohe Übereinstimmung zeigten (ergänzende Abbildung 3a). Für einzelne RNA-Cluster wurden auch zelltypspezifische Markergene identifiziert – Mapt (R2) könnte beispielsweise bei der Etablierung und Aufrechterhaltung der neuronalen Polarität eine Rolle spielen23. Epha5 (R6) ist an der Axonführung beteiligt, während Slc1a3 (R8) an der Regulierung der erregenden Neurotransmission im ZNS18 beteiligt ist. Myh3 (R3) ist mit der Muskelkontraktion verbunden24. Col2a1 (R7), das eine spezifische Expression in Knorpelgewebe zeigt, spielt eine wesentliche Rolle bei der normalen Entwicklung des embryonalen Skeletts18. Die Ergebnisse der Pathway-Analyse 25 stimmen mit der anatomischen Anmerkung überein (ergänzende Abbildung 4a).

Die Integration räumlicher RNA-Daten mit scRNA-seq-Mausorganogenesedaten12 wurde durchgeführt, um die Zellidentitäten in jedem Pixel zu bestimmen (Erweiterte Daten, Abb. 2c, d). Wir beobachteten, dass radiale Gliazellen, postmitotische vorzeitige Neuronen und inhibitorische Interneurone (Cluster R8, R6 und R2) in denselben Hauptclustern vorhanden waren, wie in der ATAC-Analyse (Cluster A7 und A6) gezeigt, die die Verwendung mehrerer Omics-Informationen für mehr bestätigte robuste Identifizierung des Zelltyps. Wir haben versucht, räumliche ATAC- und RNA-Daten gemeinsam zu gruppieren, um die räumlichen Muster zu verfeinern. In der Joint-Clustering-Analyse wurde ein neuer neuronaler Cluster (J10) identifiziert, der durch einzelne Modalitäten allein nicht ohne weiteres gelöst werden konnte (Abb. 1d, rechts). Dieses Ergebnis unterstreicht den Wert der Verwendung gemeinsamer Multiomics-Profile zur Verbesserung der räumlichen Zelltypkartierung26.

Die gemeinsame Profilierung von Epigenom und Transkriptom erleichtert die Untersuchung der Korrelation zwischen zugänglichen Peaks und exprimierten Genen Pixel für Pixel im Gewebekontext. Für einige Gene (Sox2, Pax6 und Sox1) beobachteten wir deutliche Signale bei vorhergesagten Enhancern (Erweiterte Daten, Abb. 2e und Ergänzende Abb. 4b). Beispielsweise hatten Enhancer für Sox2 und Pax6 eine bessere Zugänglichkeit des Chromatins in den Clustern A7 bzw. A3, was darauf hindeutet, dass sie in diesen Geweberegionen eine Rolle bei der Regulierung der Sox2- und Pax6-Expression spielen. Obwohl die räumliche RNA-Verteilung dieser Gene mit ihrer Zugänglichkeit für Chromatin übereinstimmte, kann das Expressionsniveau erheblich vom Grad der Zugänglichkeit abweichen (Abb. 1e und erweiterte Daten, Abb. 2b). Einige Markergene (Pax6, Sox2 und Myt1l) waren in einigen Regionen des embryonalen Gehirns gut zugänglich, zeigten jedoch eine mäßige oder niedrige RNA-Expression (Abb. 1e und erweiterte Daten Abb. 2b), was auf ein Lineage Priming10,27 dieser Gene hinweisen könnte embryonale Gehirnentwicklung. Trotz einer starken Korrelation zwischen Replikaten (ergänzende Abbildung 2d) könnte diese Beobachtung teilweise auf die Sequenzierungstiefe und die Empfindlichkeit des RNA-Nachweises zurückzuführen sein. Dennoch unterstreichen diese Ergebnisse immer noch das Potenzial, die genomweite epigenetische Regulation mit der Transkription im räumlichen Gewebekontext zu verknüpfen.

Um die räumlich-zeitliche Beziehung zwischen der Zugänglichkeit von Chromatin und der Genexpression in der Embryonalentwicklung zu untersuchen, analysierten wir den Differenzierungsverlauf von radialer Glia zu verschiedenen Arten von Neuronen, wie z. B. postmitotischen vorzeitigen Neuronen28. Die Pseudozeitanalyse29 wurde unter dem ATAC-Pseudozeitkoordinatensystem durchgeführt und Entwicklungsverläufe wurden direkt in der räumlichen Gewebekarte visualisiert (Abb. 1f). Die Zugänglichkeit von Chromatin (GAS) und die Genexpression entlang dieser Flugbahn zeigten dynamische Veränderungen in ausgewählten Markergenen (Abb. 1g, h). Wie erwartet wurden die Expressionsniveaus von Sox2, Pax6 und anderen Genen, die an der Aufrechterhaltung und Proliferation von Vorläufern beteiligt sind (Genontologie (GO) Fabp7 bis Pax6 in Extended Data, Abb. 3a), während des Übergangs zu postmitotischen Neuronen herunterreguliert. Der Verlust der Zugänglichkeit des Chromatins an den Loci von Pax6 und dem radialen Gliamarker Fabp7 ging der Herunterregulierung der entsprechenden RNAs voraus (Abb. 1h). Gene, die an der neuronalen Identität, Axonogenese und Synapsenorganisation beteiligt sind (GO Myt1l bis Dnm3 in Extended Data Abb. 3a), wie Dcx und Tubb3, zeigten wiederum eine erhöhte Expression in räumlicher Pseudozeit, aber die Zugänglichkeit von Chromatin an ihren Loci war bereits in früheren Stadien erhöht , was auf ein Abstammungs-Priming dieser Gene bei der Expression 10,27 hindeutet. Wir fanden auch eine Kohorte von Genen, deren Expression während der räumlichen Pseudozeit schnell abnahm, deren Chromatinzugänglichkeit jedoch während der gesamten Pseudozeit erhalten blieb oder erst in sehr späten Stadien abnahm. Viele dieser Gene, wie Ptprz1, Bcan und Luzp2, sind charakteristisch für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen, und die entsprechenden biologischen GO-Prozesse sind eine negative Regulation der Myelinisierung und Regulierung der Gliogenese (GO Cp zu Sparcl1 in Extended Data Abb. 3a), was darauf hindeutet Die neuronale Linie könnte das Potenzial behalten, eine Oligodendrozyten-Identität zu erlangen, selbst wenn sie bereits aus der ventrikulären Zone im embryonalen Gehirn weggewandert ist. Die Monocle2-Pseudozeitanalyse zeigte eine Gabelung in der Zugänglichkeit des Chromatins, jedoch nicht in der RNA-Expression; Ein Pfad führte zu Regionen nahe der Ventrikelzone (grüne Pixel, erweiterte Daten Abb. 3d, e) und der andere endete in Regionen distal der Ventrikelzone (blaue Pixel). Im Gegensatz zum grünen Pfad zeigte der blaue Pfad eine erhöhte Zugänglichkeit des Chromatins für Gene, die an der Axonogenese und Dendritenbildung beteiligt sind (Extended Data Abb. 3e (roter Kasten), 3f), was darauf hindeutet, dass der Chromatinzustand der Nervenzellen distal zum Ventrikel liegt entspricht einem differenzierteren neuronalen Zustand. Somit kann unsere räumliche ATAC-RNA-Seq verwendet werden, um den Genregulationsmechanismus und die raumzeitliche Dynamik während der Gewebeentwicklung zu entschlüsseln.

Wir haben einen Mikrochip mit 100 serpentinenförmigen Mikrokanälen entwickelt, um 100 × 100 oder insgesamt 10.000 Pixel pro Gewebeabschnitt und bis zu fünf Proben pro Chip zu kodieren (Abb. 2a, 20 μm Pixelgröße). Dies wurde auf Koronalschnitte des Gehirns von P22-Mäusen (bei Bregma 1) angewendet, um gemeinsam die Zugänglichkeit von Chromatin mit dem Transkriptom zu profilieren. Im Gegensatz zum embryonalen Gehirn von E13-Mäusen fanden wir eine höhere Anzahl von ATAC-Clustern (14) im Vergleich zu RNA-Clustern (11), was auf eine terminale Differenzierung der meisten wichtigen Zelltypen im jugendlichen Gehirn im Vergleich zu denen im Embryo hinweist, das aus vielen undifferenzierten Zellen besteht oder multipotente Zellzustände. Die räumliche Verteilung der Cluster stimmte mit der durch Nissl-Färbung definierten anatomischen Annotation überein und spiegelte die Arealisierung des jugendlichen Gehirns wider (Abb. 2b). Darüber hinaus zeigten räumliche Cluster zwischen ATAC und RNA eine Übereinstimmung in der Clusterzuordnung (ergänzende Abbildung 5a). Die Chromatin-Zugänglichkeit von Markergenen identifizierte Hauptregionen wie Striatum (Pde10a und Adcy5, Marker für mittelgroße stachelige Neuronen, Cluster A1), Corpus callosum (Sox10, Mbp und Tspan2, Marker für Oligodendroglia, Cluster A3), Cortex (Mef2c, Neurod6 und Nrn1). , Cluster A0 und A4, Marker erregender Neuronen; Cux2, Cluster A4) und lateraler Ventrikel (Dlx1, Pax6, Notch1 und Sox2, Marker ependymaler/neuraler Vorläuferzellen, Cluster A11) (Abb. 2e und erweiterte Daten Abb. 4a, B). Die GREAT-Analyse bestätigte, dass die Hauptpfade mit Gewebefunktionen in verschiedenen anatomischen Regionen korrelierten (ergänzende Abbildung 5b, c). Räumliche RNA-Cluster zeigten auch eine regionsspezifische Genexpression wie Striatum (Pde10a, Cluster R2, mittelgroße stachelige Neuronen), Corpus callosum (Mbp und Tspan2, Cluster R5, Oligodendroglia) und Cortex (Mef2c, Cluster R0 und R1, erregende Neuronen) ( Abb. 2e und erweiterte Daten Abb. 4a).

a, Design von Mikrofluidikchips für 100 × 100 Barcodes mit einer Kanalgröße von 20 μm. b, Räumliche Verteilung und UMAP aller Cluster für ATAC und RNA in der räumlichen ATAC-RNA-Sequenz des Mausgehirns. Pixelgröße: 20 µm; Maßstabsbalken, 1 mm. c, Integration von ATAC-Daten und scATAC-seq-Daten30 aus dem Gehirn von Mäusen. d, Integration von RNA-Daten und scRNA-seq-Daten32 aus dem Gehirn von Mäusen. e, Räumliche Kartierung von GAS und Genexpression für ausgewählte Markergene in verschiedenen Clustern für ATAC und RNA in räumlicher ATAC-RNA-Sequenz. Eine Liste der Abkürzungsdefinitionen finden Sie in der Ergänzungstabelle 1.

Die Integration von Einzelzell-ATAC-seq-Maushirnatlasdaten30 mit räumlichen ATAC-seq-Daten erleichterte die Identifizierung aller wichtigen Zelltypen, und der Markierungstransfer wurde dann verwendet, um Zelltypen räumlichen Orten zuzuordnen, an denen der epigenetische Zustand die Bildung spezifischer Zelltypen steuern kann ( Abb. 2c und erweiterte Daten Abb. 4c). Beispielsweise beobachteten wir unreife Oligodendrozyten und Oligodendrozyten im Cluster A3, der dem Corpus callosum entspricht. Basierend auf der Zugänglichkeit des Chromatins wurde eine dünne Schicht radialer gliaähnlicher Zellen im lateralen Ventrikel, mittelgroße stachelige Neuronen (D1MSN und D2MSN) im Striatum und inhibitorische Neuronen im lateralen Septumkern gefunden (Extended Data Abb. 4c). Darüber hinaus sind die Unterklassen erregender Neuronen in verschiedenen Schichten des Cortex (ITL23GL, Cortex L2/3; ITL4GL, Cortex L4; ITL5GL, Cortex L5; PTGL, Cortex PT; NPGL, Cortex NP; ITL6GL, Cortex L6; CTGL, Cortex CT; und L6bGL, Cortex L6b) wurden eindeutig identifiziert31 (Extended Data Abb. 4c). Die Integration räumlicher RNA-Daten und des juvenilen ZNS-scRNA-seq-Atlas32 ermöglichte die Visualisierung dominanter Transkriptionszelltypen im Gewebe (Abb. 2d und erweiterte Daten Abb. 4d). Wir beobachteten ein hohes Maß an Übereinstimmung in der räumlichen Zelltypverteilung, bestimmt durch ATAC im Vergleich zu RNA, was auf eine allgemeine Kongruenz zwischen Chromatinzugänglichkeit und Transkriptom bei der Definition von Zellidentitäten im Gewebe schließen lässt. Zum Beispiel neuronale intermediäre Vorläuferzellen (SZNBL, enthalten in radialen glialen Zellen aus scATAC-seq30), reife Oligodendrozyten (MOL, enthalten in Oligodendrozyten aus scATAC-seq), neu gebildete Oligodendrozyten (enthalten in unreifen Oligodendrozyten aus scATAC-seq) und mittelgroße stachelige Neuronen (MSN), die in den RNA-Daten gezeigt werden, wurden in denselben Regionen angereichert, die in den ATAC-Daten identifiziert wurden (erweiterte Daten, Abb. 4c, d). Darüber hinaus zeigte der Nachweis einer dünnen SZNBL-Schicht im lateralen Ventrikel und in vaskulären leptomeningealen Zellen (VLMC) in den Regionen mit erhaltenen Hirnhäuten eine hohe räumliche Auflösung für unsere Technologie bei der Identifizierung von Zellen mit geringer Häufigkeit, selbst bei nahezu Einzelzellauflösung (für VLMC) (Erweiterte Daten Abb. 4c, d).

Die gemeinsame Profilierung von ATAC und RNA erleichtert den Rückschluss auf die Genregulationslandschaft durch die Suche nach korrelierter Peak-Zugänglichkeit und Genexpression. Wir haben 21.417 signifikante Peak-to-Gen-Verknüpfungen zwischen regulatorischen Elementen und Zielgenen entdeckt (Extended Data Abb. 5c, d). Es wurde festgestellt, dass einige potenzielle Enhancer mit dynamisch regulierten Promotorinteraktionen in bestimmten Clustern wie Dlx1 und Sox2 (Cluster A11), Tspan2 (Cluster A3) und Adcy5 (Cluster A1) angereichert sind (Extended Data Abb. 4b), was auf die räumliche Fähigkeit hinweist ATAC-RNA-seq zur Identifizierung der wichtigsten regulatorischen Regionen für Zielgene. Räumliche Muster der TF-Motivanreicherung (Dnajc21, Pax6, Sox2, Sox4 und Mef2c) lieferten weitere Einblicke in die im Gewebe sichtbaren TF-Regulatoren (Extended Data Abb. 5a, b). Beispielsweise wurde Sox2 gleichzeitig auf Chromatinzugänglichkeit, Genexpression, mutmaßliche Enhancer und TF-Motivanreicherung untersucht, was ein umfassenderes Verständnis der Genregulationsdynamik ermöglichte. Wie im Gehirn embryonaler Mäuse beobachtet, wurden einige Markergene mit offener Chromatinzugänglichkeit (Sox10, Sox2, Neurod6, Pax6 und Notch1) entweder nicht oder nur geringfügig exprimiert (Abb. 2e und erweiterte Daten Abb. 4a). Es wurde auch ein biologisches Replikationsexperiment am Gehirn von P21-Mäusen durchgeführt (Extended Data Abb. 6; 20 μm Pixelgröße, 50 × 50 Barcodes). Viele dieser Gene kodieren für Transkriptionsfaktoren, die an der neuronalen Entwicklung beteiligt sind, was auf die Möglichkeit eines epigenetischen – aber nicht transkriptionellen – Gedächtnisses dieser Gene bei der Gehirnentwicklung schließen lässt.

Neben der Zugänglichkeit des Chromatins sind auch Histonmodifikationen ein zentraler Aspekt der epigenetischen Regulation. Spatial CUT&Tag-RNA-seq wurde durchgeführt, um das Transkriptom und die Histonmodifikationen H3K27me3 (unterdrückende Loci), H3K27ac (aktivierende Promotoren und/oder Enhancer) bzw. H3K4me3 (aktive Promotoren) im Gehirn von P22-Mäusen (Pixelgröße 20 μm) gemeinsam zu profilieren , 100 × 100 Barcodes). Wir identifizierten 13 und 15 spezifische Cluster für H3K27me3 und RNA, 12 und 13 Cluster für H3K27ac und RNA und 11 und 12 Cluster für H3K4me3 und RNA (Abb. 3a – c). Diese Cluster stimmten mit der anatomischen Annotation durch Nissl-Färbung überein und zeigten eine gute Übereinstimmung zwischen CUT&Tag und RNA in räumlichen Mustern (Abb. 3a – c), was durch Belayer34-Analyse weiter bestätigt wurde (ergänzende Abb. 7c).

a–c, Räumliche Verteilung und UMAP aller Cluster für H3K27me3 und RNA (a), H3K27ac und RNA (b) und H3K4me3 und RNA (c) im Gehirn von Mäusen. Pixelgröße: 20 µm; Maßstabsbalken, 1 mm. d, Integration von H3K27me3-Daten mit scCUT&Tag (H3K27me3)-Daten37 aus dem Gehirn von Mäusen. e, Integration von H3K27ac-Daten mit scCUT&Tag (H3K27ac)-Daten37 aus dem Gehirn von Mäusen. f, Integration von RNA-Daten in räumliche CUT&Tag (H3K27me3)-RNA-seq, räumliche CUT&Tag (H3K27ac)-RNA-seq und räumliche CUT&Tag (H3K4me3)-RNA-seq mit scRNA-seq-Daten32 aus dem Gehirn von Mäusen.

Für H3K27me3 wurde die Genexpression durch Berechnung des Chromatin-Silencing-Scores (CSS2,35; Methoden) vorhergesagt. Ein hoher CSS-Wert weist auf eine unterdrückte Genexpression aufgrund der Transkriptionsrepressionsfunktion von H3K27me3 hin. Für H3K27ac und H3K4me3 sollten aktive Gene einem hohen GAS2,13 (Methoden) entsprechen. Die Clusterung von CSS oder GAS auf der Grundlage verschiedener Modifikationen löste alle wichtigen Geweberegionen auf (Abb. 3a – c und ergänzende Abb. 6) und identifizierte regionsspezifische Markergenmodifikationen. Cux2 zeigte einen hohen GAS-Wert in Cluster C9 (H3K27ac) und Cluster C6 (H3K4me3), was auf eine Anreicherung erregender Neuronen hinweist5. Cux2 wurde in den kortikalen Schichten 2/3 beobachtet, was den oberflächlichen Schichten im Kortex entspricht. Im Gegensatz dazu war H3K27me3 bei Cux2 in derselben Region (Cluster C3) abgereichert (ergänzende Abbildung 6). Das GAS von Fezf2 (ein Markergen für die kortikale Schicht 5) war in Cluster C8 (H3K27ac) und Cluster C7 (H3K4me3) hoch, was der tieferen Schicht des Kortex entspricht. Fezf2 war in dieser Schicht für H3K27me3 (Cluster C1) erschöpft. Satb2 zeigte die höchste Aktivität in den Clustern C8 und C9 (H3K27ac) sowie C6 und C7 (H3K4me3), die niedrigste CSS jedoch in den Clustern C1 und C3 (H3K27me3) in der kortikalen Schicht. Tspan2 war in Cluster C4 (H3K27ac) und Cluster C1 (H3K4me3) angereichert, im Corpus callosum jedoch in Cluster C5 (H3K27me3) abgereichert, was mit der Entwicklung der Oligodendrozyten-Linie verbunden ist (ergänzende Abbildung 6). Die entsprechenden RNA-Cluster zeigten auch übereinstimmende regionsspezifische Signaturen (Abb. 3a – c und ergänzende Abb. 6), wie am Beispiel von Cux2 in erregenden Neuronen der kortikalen Schicht 2/3 (Cluster R5 (H3K27me3 gepaart), Cluster R5 (H3K27ac gepaart)) dargestellt. und Cluster R6 (H3K4me3 gepaart)), Fezf2 in erregenden Neuronen der kortikalen Schicht 5 (Cluster R1 (H3K27me3 gepaart), Cluster R1 (H3K27ac gepaart), Cluster R1 (H3K4me3 gepaart)), Tspan2 in Zellen der Oligodendrozytenlinie im Corpus callosum (Cluster R4). (H3K27me3 gepaart), Cluster R4 (H3K27ac gepaart) und Cluster R3 (H3K4me3 gepaart) Ergänzende Abbildung 6).

Die Integration und gemeinsame Einbettung räumlicher CUT&Tag- und scCUT&Tag-Daten (Abb. 3d, e und erweiterte Daten Abb. 7a) zeigte, dass die epigenetischen Zustände in unseren Daten für H3K27me3, H3K27ac und H3K4me3 mit der entsprechenden Projektion in scCUT&Tag übereinstimmten. Die Integration mit dem entsprechenden juvenilen ZNS-scRNA-seq-atlas32 ermöglichte einen Markierungstransfer, um transkriptionelle Zelltypen dem räumlichen Ort epigenetischer Identitäten/Zustände zuzuordnen (Extended Data Abb. 7g, h, unten). Beispielsweise beobachteten wir eine Anreicherung von MOL im Corpus callosum, einer dünnen Schicht Ependymzellen im lateralen Ventrikel, erregenden Neuronen in der Großhirnrinde und MSN im Striatum. Wir haben auch gepaarte RNA-Daten in den scRNA-seq-Atlas32 integriert, um dominante Transkriptionszelltypen durch Markierungstransfer zu identifizieren (Abb. 3f und erweiterte Daten Abb. 7b – h). MOL, eine dünne Schicht aus Ependymzellen, MSN und erregenden Neuronen, wurden in denselben räumlichen Regionen angereichert, die durch CUT&Tag (H3K27ac und H3K4me3) identifiziert wurden (Extended Data Abb. 7g, h, oben). Insbesondere für räumliches H3K27me3 konnte die Integration mit scCUT&Tag die Identität mehrerer Cluster in den epigenomischen Modalitäten (Cluster C0, C1 und C3) nicht eindeutig zeigen, die Markierungsübertragung von scRNA-seq-Daten mit gepaarten RNA-Daten aus demselben Gewebeschnitt zeigte dies jedoch deutlich Zellidentitäten in diesen Clustern (Abb. 3a, d und erweiterte Daten Abb. 7f), was die Leistungsfähigkeit der Kombination von CUT&Tag und RNA-seq (räumliches CUT&Tag-RNA-seq) im selben Gewebeabschnitt hervorhebt, um Zelltypen oder -zustände genauer zu identifizieren . Um direkt auf Wechselwirkungen zwischen der genomweiten Genexpression und den entsprechenden Enhancern in allen Clustern schließen zu können, haben wir insgesamt 19.468 signifikante Peak-zu-Gen-Verknüpfungen aus räumlichen CUT&Tag (H3K27ac)-RNA-seq identifiziert (ergänzende Abbildung 7a, b). Eine biologische Replikation wurde auch am Gehirn von P21-Mäusen durchgeführt (Extended Data Abb. 8; 20 μm Pixelgröße, 50 × 50 Barcodes).

Um die räumliche epigenetische Regulation der Genexpression auf Genomebene besser zu verstehen, verglichen wir das von ATAC und CUT&Tag (H3K27me3, H3K27ac und H3K4me3) erhaltene GAS oder CSS mit der entsprechenden RNA-Expression in allen wichtigen Geweberegionen des Gehirns von P22-Mäusen (Abb. 4a–c und ergänzende Abbildungen 9a, 10a und 11a). Beispielsweise beobachteten wir im Oligodendrozyten-reichen Corpus callosum eine starke Antikorrelation zwischen H3K27me3 und RNA (Abb. 4a). Gene wie Mal, Mag und Car2 mit niedrigem CSS und hoher RNA-Expression entsprechen GO-biologischen Prozessen wie Myelinisierung und Regulierung der Oligodendrozyten-Differenzierung (Extended Data Abb. 9a – c und Supplementary Abb. 8; GO für Quadrant IV). Im Gegensatz dazu hängen Gene wie Grin2b und Syt1 mit hoher CSS- und niedriger RNA-Expression mit neuronalen Prozessen wie der synaptischen Übertragung und der Freisetzung von Neurotransmittern zusammen (Extended Data Abb. 9d, e und Supplementary Abb. 8; GO für Quadrant II). Diese Ergebnisse stimmen mit der ATAC/H3K27me3/H3K27ac Nano-CUT&Tag-Analyse37 der oligodendroglialen Differenzierung im jugendlichen Gehirn überein, die während dieses Prozesses zwei Wellen der H3K27me3-Repression zeigte37. Wir fanden auch eine kleine Untergruppe von Genen (Abb. 4a und ergänzende Abb. 8; GO für Quadrant I) mit höheren Mengen an H3K27me3 und RNA im Corpus callosum, wie z. B. Ptprz1, einem Marker für Oligodendrozyten-Vorläuferzellen 38, 39 (Extended). Daten Abb. 9g), die auf die Transkription einiger dieser Gene hinweisen könnten. Dies könnte teilweise auch auf das Vorhandensein von Oligodendrozyten-Vorläuferzellen (die Ptprz1 exprimieren) und reifen Oligodendrozyten (wo Ptprz1 unterdrückt wird) im Corpus callosum in der Nähe zurückzuführen sein. Wir führten eine ähnliche Korrelationsanalyse für RNA und H3K27me3 in anderen Regionen des jugendlichen Gehirns durch, einschließlich des Striatums sowie der oberflächlichen und tieferen kortikalen Schichten (ergänzende Abbildungen 9a, 10a und 11a). Wir beobachteten auch eine starke Antikorrelation mit einer Kohorte von Genen, die an neuronalen Prozessen beteiligt sind und auf regionalspezifische Weise aktiviert oder unterdrückt werden. Beispielsweise waren in der oberflächlichen kortikalen Schicht Gene für die GABAerge Regulation der synaptischen Übertragung an H3K27me3 angereichert, wohingegen glutamaterge Synapsenübertragungsgene eine hohe Expression und eine niedrige H3K27me3 aufwiesen (Ergänzende Abbildungen 9b, 10b und 11b; GOs für Striatum, oberflächliche und tiefere kortikale Schichten). ). Im Gegensatz zum Corpus callosum wurde in diesen Regionen nur eine begrenzte Anzahl von Genen gefunden, die sowohl für H3K27me3 als auch für RNA positiv sind. Trotz einer allgemeinen Antikorrelation zwischen RNA-Expression und H3K27me3-Ablagerung beobachteten wir auch regionale Unterschiede (blau schattierte Säulen in Abb. 4d); Nav3 und Sncb mit geringen Mengen an H3K27me3 sowohl im Kortex als auch im Striatum wurden im ersteren exprimiert, im letzteren jedoch nicht (Extended Data Abb. 9h). Das entgegengesetzte Muster wurde für Gene wie Ablim2 und Gng7 beobachtet (Extended Data Abb. 9h). Car2, ein Markergen, das in Oligodendrozyten exprimiert wird und im Corpus callosum reichlich vorhanden ist, wies im Gegensatz zum Corpus callosum und überraschenderweise zum Striatum eine H3K27me3-Belegung in den kortikalen Schichten auf (Extended Data Abb. 9c). Daher könnten andere Mechanismen als die Polycomb-vermittelte H3K27me3-Ablagerung an der Transkriptionsrepression dieser Gene in verschiedenen Bereichen des ZNS beteiligt sein.

a–c, Korrelation der H3K27me3-CSS- und RNA-Genexpression (a), der H3K27ac-GAS- und RNA-Genexpression (b) und der H3K4me3-GAS- und RNA-Genexpression (c) im Corpus callosum. d, Upset-Plot der H3K27me3-CSS- und RNA-Genexpression im Striatum sowie in tieferen und oberflächlichen kortikalen Schichten; –, niedrige CSS- oder Genexpression; +, hohe CSS- oder Genexpression. e, Venn-Diagramme, die hohe (+) oder niedrige (–) CSS/GAS für verschiedene Histonmodifikationen im Corpus callosum mit gemeinsamen RNA-Markergenen zeigen.

Quelldaten

Im Gegensatz zu H3K27me3 beobachteten wir eine robuste Korrelation zwischen RNA und den aktivierenden Markierungen H3K4me3 oder H3K27ac im Corpus callosum, wobei Gene in diesen beiden Modalitäten, die Prozesse in Oligodendroglia regulieren, stark exprimiert und stark abgelagert wurden (Abb. 4b, c und ergänzende Abb. 12). ; GO für H3K27ac Quadrant I und H3K4me3 Quadrant I). Beispielsweise zeigte Mal die höchste Aktivität oder Expression im Corpus callosum für ATAC, H3K27ac, H3K4me3 und gepaarte RNA (Extended Data Abb. 9a). Gpr88, ein Markergen von MSN, wurde für ATAC, H3K27ac und H3K4me3 im Striatum angereichert, für H3K27me3 jedoch mit niedrigem CSS im Striatum (Extended Data Abb. 9f). Darüber hinaus untersuchten wir die kollektive Regulation verschiedener Histonmodifikationen im Corpus callosum (Abb. 4e und ergänzende Abb. 13 und 14). Im Allgemeinen zeigten H3K4me3 und H3K27ac hohe Korrelationen, wobei ihre Signale mit H3K27me3 antikorrelierten (Abb. 4e). Wir beobachteten auch die gleichzeitige Belegung von H3K4me3 oder H3K27ac und H3K27me3 in mehreren Genorten in dieser Geweberegion (Abb. 4e und ergänzende Abb. 13 und 14). Diese Gene sind an der Differenzierung und Myelinisierung von Oligodendrozyten sowie an anderen Prozessen wie dem Proteinkatabolismus und der Lokalisierung beteiligt (Ergänzende Abbildungen 13 und 14). Einige dieser Gene, wie Ptprz1 und Fnbp1, wiesen auch höhere Mengen an H3K27me3 und RNA auf (Abb. 4a). Wie oben erwähnt, könnte diese potenzielle H3K4me3/H3K27me3-Bivalenz die Transkriptionsbalance widerspiegeln.

Wir führten eine räumliche ATAC-RNA-Seq-Analyse an der Hippocampusformation des menschlichen Gehirns eines Erwachsenen (31 Jahre alt) durch, einer komplexen Gehirnregion, die an kognitiven Funktionen und Krankheiten wie der schweren Depression40 und der Alzheimer-Krankheit41 beteiligt ist. Wir identifizierten sieben bzw. acht Hauptcluster für ATAC und RNA, und das räumliche Muster stimmte mit wichtigen anatomischen Orientierungspunkten überein (Abb. 5a)3, einschließlich spezifischer Markergene (Abb. 5d). Der ATAC-Cluster A4 repräsentiert die Granulatzellschicht (GCL) (THY1, BCL11B) und Cluster A6 entspricht dem Plexus choroideus (Abb. 5a, d). TF-Motive (NEUROD1 und SNAI1) und ihre räumlichen Muster wurden in verschiedenen Geweberegionen visualisiert und positive TF-Regulatoren identifiziert (Extended Data Abb. 10b, c). Für die RNA-Daten haben wir auch unterschiedliche Cluster mit einzigartigen Markergenen (Abb. 5a, d) wie PROX1 und BCL11B entdeckt, die im Cluster R4 (GCL) angereichert sind.

a, Hellfeldbild, räumliche Verteilung und UMAP aller Cluster basierend auf ATAC und RNA im menschlichen Hippocampus. ML, molekulare Schicht; Pyr, Pyramidenneuronen. Pixelgröße: 50 μm, Maßstabsbalken: 1 mm. b, Integration unserer ATAC-Daten mit scATAC-seq-Daten42 aus dem menschlichen Hippocampus. c, Integration unserer RNA-Daten mit snRNA-seq-Daten aus dem menschlichen Gehirn43. d, Räumliche Kartierung von GAS und Genexpression für ausgewählte Markergene in verschiedenen Clustern für ATAC und RNA. Oligo, Oligodendrozyten; Astro, Astrozyten; DG, Gyrus dentatus.

Wir haben auch unsere ATAC-Daten und scATAC-seq-Daten aus menschlichen Gehirnproben42 (Abb. 5b) sowie unsere RNA-Daten mit snRNA-seq-Daten aus erwachsenen menschlichen Gehirnen43 integriert, um die dominanten Zellidentitäten und -zustände zu zeigen. Durch snRNA-seq43 identifizierte Zelltypen wurden jedem Cluster per Markierungstransfer zugeordnet (Abb. 5c und erweiterte Daten Abb. 10a). Im GCL wurden Granulatzellen (GC) nachgewiesen, Neuronen des Cornu ammonis (CA) waren in den CA3–4-Regionen angereichert und VLMC waren im Plexus choroideus im Gegensatz zu anderen Regionen stark ausgeprägt.

Im Allgemeinen können sowohl ATAC als auch RNA problemlos alle wichtigen Gewebemerkmale in dieser Region auflösen, aber die räumliche Kosequenzierung von Epigenom und Transkriptom könnte neue Einblicke in den dynamischen Genregulationsmechanismus liefern, die mit einzelnen Modalitäten nicht realisiert werden können. Beispielsweise wird PROX1, ein Signaturgen, das die Identität von Körnerneuronen während der Schicksalsselektion von Pyramidenneuronen definiert, zwar stark in GCL exprimiert, zeigte jedoch eine mäßige Zugänglichkeit des Chromatins (Abb. 5d). Dies könnte auf einen minimalen Bedarf an Synthese neuer PROX1-Transkripte in postmitotischen reifen Körnerzellen zurückgeführt werden und ist daher nicht erforderlich, um einen aktiven offenen Chromatinzustand aufrechtzuerhalten.

Räumliche Omics-Technologien (räumliche Epigenomik, Transkriptomik und Proteomik), die entweder auf NGS1,2,3,4,45,46,47 oder Bildgebung5,48 basieren, bieten eine beispiellose Möglichkeit, neue und umfassende Einblicke in die Genregulation im räumlichen Gewebe zu gewinnen Kontext. Um den Mechanismus der Genregulation jedoch umfassend zu verstehen, müssen verschiedene Schichten von Omics-Informationen gleichzeitig profiliert werden. Dies wurde erstmals in dissoziierten Einzelzellen nachgewiesen6,7,8,9, muss aber noch direkt im Gewebe realisiert werden. Bildgebungsbasierte sequenzielle DNA-Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung kombiniert mit RNA-sequentieller Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung erfasste räumliches Chromatin und Genexpression für Zielgene und ausgewählte genomische Loci49. Bis heute ist es mit aktuellen Technologien nicht möglich, eine unvoreingenommene genomweite Vergleichung von Epigenom und Transkriptom am selben Gewebeabschnitt auf zellulärer Ebene durchzuführen. Wir haben eine räumliche ATAC-RNA-Sequenz und eine räumliche CUT&Tag-RNA-Seq (angewendet auf H3K27me3, H3K27ac und H3K4me3) entwickelt, um die genomweite Zugänglichkeit von Chromatin oder Histonmodifikationen in Verbindung mit dem gesamten Transkriptom auf demselben Gewebeabschnitt bei nahezu Einzelzellenauflösung (verfügbar für räumliches Browsen, siehe „Datenverfügbarkeit“). Diese Techniken wurden zur Komprimierung des Gehirns embryonaler und jugendlicher Mäuse sowie des Gehirns erwachsener Menschen angewendet. Die räumliche Epigenom-Transkriptom-Kosequenzierung lieferte zwei Schichten räumlicher Omics-Informationen direkt im Gewebe, mit einer Datenqualität, die derjenigen ähnelte, die zuvor mit einzelnen Modalitäten erhalten wurde. Diese Technologien ermöglichen es uns, raumzeitliche Dynamiken und genomweite Genregulationsmechanismen im Gewebekontext zu untersuchen.

Wir haben entweder ATAC oder CUT&Tag in Verbindung mit RNA für die räumliche Multiomics-Kartierung demonstriert. Es könnte möglich sein, alle drei Faktoren – Zugänglichkeit des Chromatins, Histonmodifikationen und Transkriptom – zu kombinieren, um eine umfassendere Landschaft des Genregulationsnetzwerks im Gewebe abzugrenzen. Es könnte auch möglich sein, mehrere Histonmodifikationen gleichzeitig zu messen, um den Multivalenzeffekt auf die räumliche Genexpressionsregulation zu bewerten. Zuvor haben wir die räumliche Profilierung des Transkriptoms und einer großen Anzahl von Proteinen demonstriert1. Wir gehen davon aus, dass es möglich und äußerst wertvoll ist, Epigenom, Transkriptom und Proteom50 weiter zu kombinieren, um räumliche Muster von Zelltyp, -zustand und Genregulation zu analysieren. Schließlich könnte die hier beschriebene räumliche Multiomik weitreichende Anwendungen über die Neurowissenschaften und Entwicklungsbiologie hinaus finden. Beispielsweise validieren mehrere Modalitäten für die räumliche Kartierung menschlicher Krankheitsgewebe nicht nur einander, sondern klären auch besser die Mechanismen auf, die abnormale Zellzustände auslösen, die mit Einzelmodalitätsmethoden nicht ohne weiteres erkannt werden könnten. Darüber hinaus können räumliche Informationen darüber hinaus zeigen, wie sich die lokale Gewebeumgebung auf den Zellzustand, die Dynamik und die Funktion auf allen Ebenen des zentralen Dogmas auswirkt. In dieser Arbeit haben wir ein Gerät mit einem größeren Kartierungsbereich und einem höheren Durchsatz entwickelt, das die Kartierung eines vierfach größeren Gewebebereichs mithilfe von 100 × 100 Barcodes (insgesamt 10.000 Pixel, 20 μm Pixelgröße) ermöglicht, um fast die gesamte Hemisphäre abzudecken Ein koronaler Schnitt des Gehirns einer juvenilen P22-Maus. Das Serpentinenkanaldesign ermöglicht die gleichzeitige Verarbeitung von fünf Gewebeproben, die jeweils für 10.000 Pixel abgebildet werden. Es ist möglich, den Kartierungsbereich durch eine Erhöhung der Anzahl der Barcodes weiter zu vergrößern und den Durchsatz durch automatisiertes Liquid Handling weiter zu steigern.

Zusammenfassend stellt die räumlich aufgelöste, genomweite Kosequenzierung von Epigenom und Transkriptom auf zellulärer Ebene eines der aussagekräftigsten Werkzeuge der Raumbiologie dar und kann auf ein breites Spektrum biologischer und biomedizinischer Forschung angewendet werden.

Sagittale Gefrierschnitte des Maus-C57-Embryos (Nr. MF-104-13-C57) wurden von Zyagen gekauft. Frisch geerntete E13-Mausembryonen wurden in Verbindungen mit optimaler Schnitttemperatur eingefroren und mit einer Dicke von 7–10 μm geschnitten. Gewebeschnitte wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern (Electron Microscopy Sciences, Nr. 63478-AS) gesammelt.

Gehirngewebe von juvenilen Mäusen (P21–P22) wurde aus der Linie Sox10:Cre-RCE:LoxP Enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP) auf einem gemischten genetischen C57BL/6xCD1-Hintergrund erhalten, der am Karolinska Institutet gepflegt wird. Die Linie wurde zunächst durch Kreuzung von Sox10:Cre-Tieren (The Jackson Laboratory, Nr. 025807) mit RCE:loxP (eGFP)-Tieren (The Jackson Laboratory, Nr. 032037-JAX) erzeugt. Dies wurde festgestellt und aufrechterhalten, indem Männchen, denen das Cre-Allel fehlte, mit Weibchen gekreuzt wurden, die ein hemizygotes Cre-Allel trugen; Das Reporter-Allel blieb sowohl bei Männern als auch bei Frauen homozygot oder hemizygot. Dies führte zu einer spezifischen Markierung der Oligodendrozyten-Linie mit eGFP. Alle Tiere waren frei von bakteriellen und viralen Mauserregern, Ektoparasiten und Endoparasiten. Für die Mäuse wurde der folgende Hell-Dunkel-Zyklus eingehalten: Morgendämmerung, 06:00–07:00; Tageslicht, 07:00–18:00; Abenddämmerung, 18:00–19:00; Nacht, 19:00–06:00 Uhr. Die Mäuse wurden in individuell belüfteten Käfigen mit maximal fünf Mäusen pro Käfig gehalten (IVC sealsafe GM500, tecniplast). Allgemeine Haltungsparameter wie Temperatur, Belüftung und relative Luftfeuchtigkeit folgten der Europäischen Konvention zum Schutz von Wirbeltieren, die für experimentelle und andere wissenschaftliche Zwecke verwendet wurden. Die Luftqualität wurde mithilfe eigenständiger Lüftungsgeräte kontrolliert, die mit einem hocheffizienten Partikelluftfilter ausgestattet waren. Die relative Luftfeuchtigkeit betrug konstant 55 ± 10 %, bei einer Temperatur von 22 °C. Die Haltungsparameter wurden mit ScanClime (Scanbur)-Geräten überwacht. Die Käfige enthielten einen Unterschlupf aus Karton, Nagerstöcke und Nistmaterial (Scanbur), platziert auf Hartholzbetten (TAPVEI). Die Mäuse erhielten eine regelmäßige Futterdiät und Wasser wurde aus einer Wasserflasche bereitgestellt und wöchentlich gewechselt. Die Käfige wurden alle zwei Wochen in einem Laminar-Air-Flow-Schrank gewechselt.

Mäuse wurden bei P21/P22 (beide Geschlechter wurden verwendet) durch Anästhesie mit Ketamin (120 mg kg–1 Körpergewicht) und Xylazin (14 mg kg–1 Körpergewicht) getötet, gefolgt von einer transkraniellen Perfusion mit kalter, mit Sauerstoff angereicherter künstlicher Liquor cerebrospinalis (87). mM NaCl, 2,5 mM KCl, 1,25 mM NaH2PO4, 26 mM NaHCO3, 75 mM Saccharose, 20 mM Glucose, 1 mM CaCl2*2H2O und 2 mM MgSO4*7H2O in destilliertem H2O). Nach der Isolierung wurden die Gehirne für einen minimalen Zeitraum in künstlicher Liquor cerebrospinalis gehalten, bis sie in die Tissue-Tek OCT-Verbindung (Sakura) eingebettet und mit einer Mischung aus Trockeneis und Ethanol schockgefrostet wurden. Koronale Kryoschnitte von 10 μm wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern (Nr. 63478-AS, Electron Microscopy Sciences) oder 2 × 3 Quadratzoll großen Glasobjektträgern (AtlasXomics) montiert.

Alle experimentellen Verfahren wurden gemäß der europäischen Richtlinie Nr. durchgeführt. 2010/63/EU, lokale schwedische Richtlinie Nr. L150/SJVFS/2019:9, Saknr.-Nr. L150 und ergänzende Richtlinien des Karolinska Institutet für die Beschaffung und Verwendung von Labortieren, Nr. Dnr. 1937/03-640. Alle beschriebenen Verfahren wurden vom örtlichen Komitee für ethische Experimente an Labortieren in Schweden genehmigt (Stockholms Norra Djurförsöksetiska nämnd, Nr. 1995/2019 und 7029/2020).

Menschliches Gehirngewebe wurde aus der Gehirnsammlung des New York State Psychiatric Institute der Columbia University gewonnen, zu der auch Gehirnproben aus der Republik Mazedonien gehören. Die Entnahme von Gehirngewebe erfolgte mit Genehmigung des Institutional Review Board des New York State Psychiatric Institute und der Einverständniserklärung der nächsten Angehörigen, die sich bereit erklärten, die Gehirne zu spenden und an psychologischen Autopsieinterviews teilzunehmen.

Wir analysierten Gehirn-Hippocampus-Gewebe eines 31-jährigen kaukasischen Mannes ohne psychiatrische oder neurologische Diagnose, der an einem traumatischen Unfall gestorben war und vor seinem Tod ein hohes Maß an globaler Funktionsfähigkeit aufwies, gemessen anhand der globalen Bewertungsskala51 90 (Bewertung 1–100, wobei 100 die höchste Funktion darstellt) und mit negativer Toxikologie für Psychopharmaka und Drogen. Das postmortale Intervall (Zeit vom Tod bis zur Gehirnentnahme) betrug 6,5 Stunden.

Die vordere Hippocampusregion wurde aus einem frisch gefrorenen koronalen Abschnitt (20 mm Dicke) der rechten Gehirnhälfte präpariert. Die Region des Gyrus dentatus (ca. 10 × 10 mm2) der vorderen Hippocampusregion wurde ausgewählt. Kryoschnitte von 10 μm wurden auf mit Poly-L-Lysin beschichteten Glasobjektträgern (Nr. 63478-AS, Electron Microscopy Sciences) gesammelt. Die Proben wurden bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert.

Unbeladene Tn5-Transposase (Nr. C01070010) und pA-Tn5 (Nr. C01070002) wurden von Diagenode gekauft und das Transposom gemäß den Richtlinien des Herstellers zusammengesetzt. Die für die Transposomenassemblierung verwendeten Oligos waren:

Tn5ME-A, 5′-TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG-3′,

Tn5MErev, 5′-/5Phos/CTGTCTCTTATACACATCT-3′ und

Tn5ME-B, 5′-/5Phos/CATCGGCGTACGACTAGATGTGTATAAGAGACAG-3′

Für die PCR und den Bibliotheksaufbau verwendete DNA-Oligos sind in der Ergänzungstabelle 4 aufgeführt. Alle DNA-Barcode-Sequenzen sind in den Ergänzungstabellen 5 und 6 und alle anderen Chemikalien und Reagenzien in der Ergänzungstabelle 7 aufgeführt.

Von Front Range Photomasks wurden Chrom-Fotomasken mit einer Kanalbreite von entweder 20 oder 50 μm erworben. Die Formen für Mikrofluidikgeräte aus Polydimethylsiloxan (PDMS) wurden mithilfe der Standardfotolithographie hergestellt. Die Richtlinien des Herstellers wurden befolgt, um SU-8-negativen Fotolack (Nr. SU-2025 und SU-2010, Microchem) auf einen Siliziumwafer (Nr. C04004, WaferPro) aufzuschleudern. Die Höhen der Merkmale betrugen etwa 20 bzw. 50 μm für 20 bzw. 50 μm breite Geräte. PDMS-Mikrofluidikgeräte wurden unter Verwendung der SU-8-Formen hergestellt. Wir haben Härter und Grundierungsmittel im Verhältnis 1:10 gemischt und die Mischung in die Formen gegossen. Nach 30-minütiger Entgasung wurde die Mischung 2 Stunden lang bei 70 °C ausgehärtet. Das verfestigte PDMS wurde zur weiteren Verwendung extrahiert. Wir haben ein detailliertes Protokoll für die Herstellung und Vorbereitung des PDMS-Geräts52 veröffentlicht.

Gefrorene Gewebeträger wurden 10 Minuten lang bei Raumtemperatur aufgetaut. Das Gewebe wurde mit Formaldehyd (0,2 %, mit 0,05 U μl–1 RNase-Inhibitor) 5 Minuten lang fixiert und mit 1,25 M Glycin weitere 5 Minuten lang gequencht. Nach der Fixierung wurde das Gewebe zweimal mit 1 ml 0,5 × DPBS-RI gewaschen und mit entionisiertem (DI) H2O gereinigt.

Die Gewebepermeabilisierung wurde mit 200 μl Lysepuffer (3 mM MgCl2, 0,01 % Tween-20, 10 mM Tris-HCl pH 7,4, 0,01 % NP40, 10 mM NaCl, 1 % Rinderserumalbumin (BSA), 0,001 % Digitonin) durchgeführt , 0,05 U μl–1 RNase-Inhibitor) für 15 Min. gewaschen und zweimal mit 200 μl Waschpuffer (10 mM Tris-HCl pH 7,4, 10 mM NaCl, 3 mM MgCl2, 1 % BSA, 0,1 % Tween-20) für 5 gewaschen Mindest. Transpositionsmischung (5 μl hausgemachtes Transposom, 33 μl 1× DPBS, 50 μl 2× Tagmentierungspuffer, 1 μl 1 % Digitonin, 1 μl 10 % Tween-20, 0,05 U μl–1 RNase-Inhibitor, 10 μl nukleasefreies H2O wurden zugegeben und 30 Minuten bei 37 °C inkubiert. Als nächstes wurden 200 μl 40 mM EDTA mit 0,05 U μl–1 RNase-Inhibitor zugegeben und 5 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert, um die Transposition zu stoppen. Abschließend wurden die Gewebeschnitte zweimal 5 Minuten lang mit 200 μl 0,5 × PBS-RI gewaschen und mit entionisiertem Wasser gereinigt.

Für RT wurde die folgende Mischung verwendet: 12,5 μl 5 × RT-Puffer, 4,5 μl RNase-freies Wasser, 0,4 μl RNase-Inhibitor, 0,8 μl Superase In RNase-Inhibitor, jeweils 3,1 μl 10 mM Desoxynukleotidtriphosphat, 6,2 μl Maxima H Minus Reverse Transkriptase, 25 μl 0,5 × PBS-RI und 10 μl RT-Primer. Die Gewebe wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und dann 90 Minuten lang bei 42 °C in einer Nassbox inkubiert. Nach der RT-Reaktion wurden die Gewebe 5 Minuten lang mit 1 × NEBuffer 3.1 und 1 % RNase-Inhibitor gewaschen.

Für die In-situ-Ligation mit dem ersten Barcode (Barcode A) wurde der erste PDMS-Chip auf den interessierenden Gewebebereich abgedeckt. Zu Ausrichtungszwecken wurde ein 10-fach-Objektiv (Thermo Fisher Scientific, EVOS FL Auto-Mikroskop Nr. AMF7000, EVOS FL Auto 2 Software Revision 2.0.2094.0) verwendet, um ein Hellfeldbild aufzunehmen. Das PDMS-Gerät und der Gewebeträger wurden mit einer selbstgebauten Acrylklemme festgeklemmt. Barcode A wurde zunächst mit Ligationslinker 1, 10 μl 100 μM Ligationslinker, 10 μl 100 μM jeweils Barcode A und 20 μl 2× Annealing-Puffer (20 mM Tris pH 7,5–8,0, 100 mM NaCl, 2 mM EDTA) annealed ) und gut vermischt. Für jeden Kanal wurden 5 μl Ligationsmastermischung mit 2 μl Ligationsmischung (27 μl T4-DNA-Ligasepuffer, 72,4 μl RNase-freies Wasser, 5,4 μl 5 % Triton X-100, 11 μl T4-DNA) hergestellt Ligase), 2 μl 1× NEBuffer 3.1 und 1 μl jedes annealten DNA-Barcodes A (A1−A50/A100, 25 μM). Mithilfe von Vakuum wurde die Ligationsmastermischung in 50 Kanäle des Geräts geladen, gefolgt von einer 30-minütigen Inkubation bei 37 °C in einer Nassbox. Der PDMS-Chip und die Klemme wurden nach 5-minütigem Waschen mit 1× NEBuffer 3.1 entfernt. Der Objektträger wurde mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet.

Für die In-situ-Ligation des zweiten Barcodes (Barcode B) wurde der zweite PDMS-Chip auf den Objektträger gelegt und ein weiteres Hellfeldbild mit dem 10-fach-Objektiv aufgenommen. Zum Zusammenklemmen des PDMS und des Gewebeobjektträgers wurde eine Acrylklemme verwendet. Das Annealing der Barcodes B (B1–B50/B100, 25 μM) und die Vorbereitung des Ligationsmastermixes erfolgten wie für Barcodes A. Das Gerät wurde 30 Minuten lang bei 37 °C in einer Nassbox inkubiert. Der PDMS-Chip und die Klemme wurden nach 5-minütigem Waschen mit 1 × DPBS mit SUPERase-In-RNase-Inhibitor entfernt. Der Objektträger wurde mit Wasser gewaschen und an der Luft getrocknet. Anschließend wurde zur weiteren Ausrichtung ein Hellfeldbild aufgenommen.

Zur Gewebelyse wurde der interessierende Bereich mit 100 μl einer umgekehrten Vernetzungsmischung (0,4 mg ml–1 Proteinase K, 1 mM EDTA, 50 mM Tris-HCl pH 8,0, 200 mM NaCl, 1 % SDS) bei 58 °C verdaut für 2 Stunden in einer Nassbox. Das Lysat wurde in einem 1,5-m-Röhrchen gesammelt und über Nacht bei 65 °C inkubiert.

Zur DNA- und cDNA-Trennung wurde das Lysat mit Zymo DNA Clean & Concentrator-5 gereinigt und mit 100 μl RNase-freiem Wasser eluiert. Der 1× B&W-Puffer mit 0,05 % Tween-20 wurde zum dreimaligen Waschen von 40 μl Dynabeads MyOne Streptavidin C1-Kügelchen verwendet. Dann wurden 100 μl 2× B&W-Puffer mit 2,5 μl SUPERase-In-RNase-Inhibitor verwendet, um die Perlen zu resuspendieren, die dann mit dem Lysat gemischt wurden und 1 Stunde lang unter Rühren bei Raumtemperatur binden konnten. Ein Magnet wurde verwendet, um Perlen und Überstand im Lysat zu trennen.

Der Überstand wurde für den Aufbau der ATAC-Bibliothek entfernt, dann mit Zymo DNA Clean & Concentrator-5 gereinigt und mit 20 μl RNase-freiem Wasser eluiert. PCR-Lösung (25 μl 2× NEBNext Master Mix, 2,5 μl 25 μM indizierter i7-Primer, 2,5 μl 25 μM P5-PCR-Primer) wurde hinzugefügt und gut gemischt. Die PCR wurde zunächst mit dem folgenden Programm durchgeführt: 5 Minuten lang bei 72 °C, 30 Sekunden lang bei 98 °C und 10 Sekunden lang bei 98 °C, 30 Sekunden lang bei 63 °C und 1 Minute lang bei 72 °C, fünfmal. Um zusätzliche Zyklen zu bestimmen, wurde die voramplifizierte Mischung (5 μl) mit quantitativer PCR (qPCR)-Lösung (5 μl 2× NEBNext Master Mix, 0,24 μl 25× SYBR Green, 0,5 μl 25 μM neuer P5 PCR-Primer) gemischt , 3,76 μl nukleasefreies H2O, 0,5 μl 25 μM indizierter i7-Primer). Die qPCR-Reaktion wurde dann mit dem folgenden Programm durchgeführt: 98 °C für 30 s mit Zyklen bei 98 °C für 10 s, 63 °C für 30 s und 72 °C für 1 min, 20 Mal. Die verbleibende voramplifizierte DNA (45 μl) wurde durch die Durchführung zusätzlicher Zyklen gemäß qPCR amplifiziert (um ein Drittel des gesättigten Signals zu erreichen). Das endgültige PCR-Produkt wurde mit 1× Ampure XP-Beads (45 μl) gereinigt und in 20 μl nukleasefreiem H2O eluiert.

Die Perlen wurden für den Aufbau der cDNA-Bibliothek verwendet. Sie wurden zunächst zweimal mit 400 μl 1× B&W-Puffer mit 0,05 % Tween-20 und einmal mit 10 mM Tris pH 8,0 mit 0,1 % Tween-20 gewaschen. Streptavidin-Kügelchen mit gebundenen cDNA-Molekülen wurden in einer TSO-Lösung (jeweils 22 μl 10 mM Desoxynukleotidtriphosphat, 44 μl 5× Maxima RT-Puffer, 44 μl 20 %ige Ficoll PM-400-Lösung, 88 μl RNase-freies Wasser, 5,5 μl 100 μM Template-Switch-Primer (AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGAATrGrG+G), 11 μl Maxima H Minus Reverse Transkriptase, 5,5 μl RNase-Inhibitor). Die Perlen wurden 30 Minuten lang bei Raumtemperatur und dann 90 Minuten lang bei 42 °C unter leichtem Schütteln inkubiert. Nachdem die Perlen einmal mit 400 μl 10 mM Tris und 0,1 % Tween-20 und einmal mit Wasser gewaschen wurden, wurden sie in einer PCR-Lösung (110 μl 2× Kapa HiFi HotStart Master Mix, 8,8 μl 10 μM Primer 1 und 2) resuspendiert , 92,4 μl RNase-freies Wasser). Der PCR-Thermozyklus wurde mit dem folgenden Programm durchgeführt: 3 Minuten bei 95 °C und 20 Sekunden bei 98 °C, 45 Sekunden bei 65 °C und 3 Minuten bei 72 °C, fünfmal. Nach fünf Zyklen wurden die Perlen aus der PCR-Lösung entfernt und 25× SYBR Green in 1× Konzentration hinzugefügt. Die Proben wurden erneut in ein qPCR-Gerät mit den folgenden Thermocycling-Bedingungen gegeben: 3 Minuten bei 95 °C, 20 Sekunden bei 98 °C, 20 Sekunden bei 65 °C und 3 Minuten bei 72 °C, 15 Mal, gefolgt von 5 min. bei 72 °C. Die Reaktion wurde entfernt, sobald das qPCR-Signal ein Plateau zu erreichen begann. Das PCR-Produkt wurde mit 0,8× Ampure XP-Beads gereinigt und in 20 μl nukleasefreiem H2O eluiert.

Für die Bibliotheksvorbereitung wurde ein Nextera XT Library Prep Kit verwendet. Gereinigte cDNA (1 ng) wurde in RNase-freiem Wasser auf ein Gesamtvolumen von 5 μl verdünnt, dann wurden 10 μl Tagment-DNA-Puffer und 5 μl Amplicon-Tagment-Mix zugegeben und 5 Minuten lang bei 55 °C inkubiert; Anschließend wurden 5 μl NT-Puffer zugegeben und 5 Minuten bei Raumtemperatur inkubiert. PCR-Masterlösung (15 μl PCR-Mastermix, 1 μl 10 μM P5-Primer, 1 μl 10 μM indizierter P7-Primer, 8 μl RNase-freies Wasser) wurde zugegeben und die PCR-Reaktion mit dem folgenden Programm durchgeführt: 95 ° C für 30 s, Zyklen bei 95 °C für 10 s, 55 °C für 30 s, 72 °C für 30 s und 72 °C für 5 min, für 12 Zyklen. Das PCR-Produkt wurde mit 0,7× Ampure XP-Beads gereinigt, um die Bibliothek zu erhalten.

Zur Bestimmung der Größenverteilung und Konzentration der Bibliothek vor der Sequenzierung wurde ein Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip verwendet. NGS wurde auf einem Illumina NovaSeq 6000-Sequenzer (Paired-End-Modus mit 150 Basenpaaren) durchgeführt.

Der gefrorene Gewebeträger wurde 10 Minuten lang bei Raumtemperatur aufgetaut. Das Gewebe wurde mit Formaldehyd (0,2 %, mit 0,05 U μl–1 RNase-Inhibitor) 5 Minuten lang fixiert und mit 1,25 M Glycin weitere 5 Minuten lang gequencht. Nach der Fixierung wurde das Gewebe zweimal mit 1 ml Waschpuffer (150 mM NaCl, 20 mM HEPES pH 7,5, eine Tablette Protease-Inhibitor-Cocktail, 0,5 mM Spermidin) gewaschen und in entionisiertes Wasser getaucht. Der Gewebeschnitt wurde mit NP40-Digitonin-Waschpuffer (0,01 % Digitonin, 0,01 % NP40 in Waschpuffer) 5 Minuten lang permeabilisiert. Der primäre Antikörper (1:50-Verdünnung mit Antikörperpuffer (0,001 % BSA, 2 mM EDTA in NP40-Digitonin-Waschpuffer) wurde unter Inkubation bei 4 °C über Nacht hinzugefügt. Der sekundäre Antikörper (Meerschweinchen-Anti-Kaninchen-IgG, 1:50 Verdünnung mit NP40-Digitonin-Waschpuffer) wurde zugegeben und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur inkubiert. Das Gewebe wurde dann 5 Minuten lang mit Waschpuffer gewaschen. Eine 1:100-Verdünnung des pA-Tn5-Adapterkomplexes in 300-Waschpuffer (eine Tablette) wurde hinzugefügt (Protease-Inhibitor-Cocktail, 300 mM NaCl, 0,5 mM Spermidin, 20 mM HEPES pH 7,5) wurde zugegeben und 1 Stunde lang bei Raumtemperatur inkubiert, gefolgt von einem 5-minütigen Waschvorgang mit 300-Waschpuffer. Tagmentierungspuffer (10 mM MgCl2 in 300 -Waschpuffer) wurde unter 1-stündiger Inkubation bei 37 °C zugegeben. Anschließend wurden 40 mM EDTA mit 0,05 U μl–1 RNase-Inhibitor unter 5-minütiger Inkubation bei Raumtemperatur hinzugefügt, um die Tagmentierung zu stoppen. Das Gewebe wurde zweimal mit 0,5× gewaschen DPBS-RI für 5 Minuten zur weiteren Verwendung.

Für RT, zwei Ligationen und Bead-Trennung galten die gleichen Protokolle wie für die räumliche ATAC-RNA-Sequenz. Für den Aufbau der CUT&Tag-Bibliothek wurde der Überstand mit Zymo DNA Clean & Concentrator-5 gereinigt und mit 20 μl RNase-freiem Wasser eluiert. PCR-Lösung (jeweils 2 μl 10 μM P5-PCR-Primer und indizierter i7-Primer, 25 μl NEBNext Master Mix) wurde zugegeben und gut gemischt. Die PCR wurde mit dem folgenden Programm durchgeführt: 5 Min. bei 58 °C, 5 Min. Inkubation bei 72 °C und 30 Sek. bei 98 °C, dann 10 Sek. lang zyklisch bei 98 °C, mit 10 Sek. Inkubation bei 60 °C 12 Zeiten und eine abschließende Inkubation bei 72 °C für 1 Minute. Das PCR-Produkt wurde mit 1,3× Ampure XP-Beads unter Verwendung des Standardprotokolls gereinigt und in 20 μl nukleasefreiem H2O eluiert. Der Aufbau der cDNA-Bibliothek folgte dem räumlichen ATAC-RNA-seq-Protokoll.

Zur Bestimmung der Größenverteilung und Konzentration der Bibliothek vor der Sequenzierung wurde ein Agilent Bioanalyzer High Sensitivity Chip verwendet. NGS wurde auf einem Illumina NovaSeq 6000-Sequenzer (Paired-End-Modus mit 150 Basenpaaren) durchgeführt.

Für ATAC- und CUT&Tag-Daten wurden die Linker 1 und 2 zum Filtern von Read 2 verwendet und die Sequenzen wurden in das Cell Ranger ATAC v.1.2-Format (10X Genomics) konvertiert. Genomsequenzen befanden sich im neu gebildeten Read 1 und die Barcodes A und B waren im neu gebildeten Read 2 enthalten. Zur Ausrichtung der Fastq-Dateien wurde eine menschliche Referenz (GRCh38) oder eine Mausreferenz (GRCm38) verwendet. Die so erhaltenen BED-ähnlichen Fragmente wurden zur Durchführung einer nachgelagerten Analyse verwendet. Die Fragmentdatei enthält Fragmente mit Informationen zu räumlichen Standorten (Barcode A × Barcode B) und dem Genom.

Für RNA-Daten wurde Lesevorgang 2 verfeinert, um Barcode A, Barcode B und UMI zu extrahieren. ST-Pipeline v.1.7.2 (Ref. 53) wurde verwendet, um den verarbeiteten Read 1 gegen das Mausgenom (GRCm38) oder das menschliche Genom (GRCh38) abzubilden, wodurch die Genmatrix für die nachgelagerte Analyse erstellt wurde, die Informationen zu Genen und räumlichen Standorten enthält (Barcode A × Barcode B).

Wir haben zunächst mithilfe von MATLAB 2020b (https://github.com/edicliuyang/Hiplex_proteome) die Position von Pixeln auf dem Gewebe anhand des Hellfeldbilds identifiziert.

Signac v.1.8 (Ref. 54) wurde in R v.4.1 geladen. ATAC-, CUT&Tag- und RNA-Matrizen wurden in Signac v.1.8 eingelesen (Lit. 54). Für den RNA-Assay wurde die Funktion „DefaultAssay“ verwendet. Für die RNA-Datenvisualisierung wurde das Feature mit der Funktion „FindVariableFeatures“ auf 3.000 gesetzt, dann wurden die Daten mit der Funktion „SCTransform“ normalisiert. Normalisierte RNA-Daten wurden geclustert und RNA-UMAP erstellt. Die DefaultAssay-Funktion wurde auf den ATAC/CUT&Tag-Assay angewendet. Für die ATAC/CUT&Tag-Datenvisualisierung wurde der Mindestgrenzwert mit der Funktion „FindTopFeatures“ festgelegt. Die Daten wurden mithilfe latenter semantischer Indizierung normalisiert und dimensional reduziert, dann wurden ATAC/CUT&Tag-Daten geclustert und ATAC/CUT&Tag UMAP erstellt.

Für den gemeinsamen ATAC/CUT&Tag- und RNA-Assay wurde die Funktion DefaultAssay verwendet. Zur Visualisierung gemeinsamer ATAC/CUT&Tag- und RNA-Daten55 wurde die Funktion „FindMultiModalNeighbors“ verwendet. Die Reduktionsliste wurde auf ('pca', 'lsi') gesetzt, die Dimensionsliste wurde auf die für RNA und ATAC/CUT&Tag gesetzt, die Modalität „weight.name“ wurde auf „RNA-Gewicht“ gesetzt und die gemeinsame UMAP wurde erstellt.

Um die oben generierten UMAPs zusammen darzustellen, wurde DefaultAssay auf RNA eingestellt und die UMAPs für ATAC/CUT&Tag, RNA oder gemeinsames ATAC/CUT&Tag und RNA wurden separat mithilfe von „DimPlot“ visualisiert.

Im Hinblick auf die Visualisierung räumlicher RNA-Daten wurde die aus RNA erhaltene Genmatrix als Seurat-Objekt in Seurat v.4.1 (Lit. 56) geladen und von Signac erhaltene RNA-Metadaten wurden in das Seurat-Objekt eingelesen. Alle räumlichen Karten wurden dann mit der Funktion „SpatialPlot“ geplottet.

Im Hinblick auf die Visualisierung räumlicher ATAC/CUT&Tag-Daten wurde die von ATAC/CUT&Tag erhaltene Fragmentdatei als ArchRProject in ArchR v.1.0.1 (Ref. 13) eingelesen und die von Signac erhaltenen ATAC/CUT&Tag-Metadaten wurden in das ArchRProject eingelesen. Die Daten von ArchRProject wurden mithilfe der iterativen latenten semantischen Indizierung normalisiert und dimensional reduziert. Für die GAS- und CSS-Berechnung haben wir das Gene Score-Modell in ArchR verwendet. Für die nachgelagerte Analyse wurde eine Gen-Score-Matrix erstellt. Die Funktionen „getMarkerFeatures“ und „getMarkers“ in ArchR (testMethod = „Wilcoxon“, cutOff = „FDR <= 0.05“, groupBy = „seurat_cluster“) wurden verwendet, um die Markergene/-regionen für jeden Cluster zu finden. Um räumliche Daten zu visualisieren, wurden die von ArchR erhaltenen Ergebnisse in Seurat v.4.1 eingegeben, um die Daten wieder dem Gewebe zuzuordnen. Die Pixelgröße wurde zur besseren Visualisierung mithilfe des Parameters „pt.size.factor“ im Seurat-Paket skaliert.

Für Peak-zu-Gen-Links geben wir das RNA-Seurat-Objekt mit der Funktion „addGeneIntegrationMatrix“ in ArchR ein, dann wurden Peak-zu-Gen-Links mit der Funktion „addPeak2GeneLinks“ gezeichnet. Die gemeinsame Zugänglichkeit von Peaks wurde mithilfe der Funktion „addCoAccessibility“ in ArchR berechnet.

Seurat v.4.1 (Ref. 56) wurde für die RNA-Datenintegration und Zelltypidentifizierung sowie die Funktion „SCTransform“ zur Normalisierung unserer räumlichen RNA- und scRNA-seq-Daten verwendet. Die Funktion „SelectIntegrationFeatures“ wurde verwendet, um gemeinsame Merkmale der beiden Datensätze zu erhalten. Die Funktion „FindIntegrationAnchors“ wurde angewendet, um Anker zu finden, und die Funktion „IntegrateData“, um über die identifizierten Anker einen integrierten Datensatz zu erstellen. Der erhaltene integrierte Datensatz wurde geclustert und zeigte eine gute Übereinstimmung zwischen unseren räumlichen RNA- und scRNA-seq-Daten. Mit der Funktion „FindTransferAnchors“ wurden Übertragungsanker gefunden, die dann zur Etikettenübertragung mit der Funktion „TransferData“ verwendet wurden (wenn mehr als ein Zelltyp in einem Pixel dargestellt wurde, wurde der Hauptzelltyp zugewiesen).

Signac v.1.8 und Seurat v.4.1 wurden für die Integration unserer ATAC/CUT&Tag- und scATAC-seq/scCUT&Tag-Daten verwendet. Die scATAC-seq/scCUT&Tag-Daten wurden gemäß unseren ATAC/CUT&Tag-Daten quantifiziert, um sicherzustellen, dass in beiden Datensätzen gemeinsame Merkmale vorhanden waren. Die Funktion FindIntegrationAnchors (reduction = „rlsi“) wurde verwendet, um Anker zwischen den beiden Datensätzen zu identifizieren. Die Funktion „IntegrateEmbeddings“ wurde verwendet, um über die identifizierten Anker einen integrierten Datensatz zu erhalten. Der erhaltene integrierte Datensatz wurde geclustert und zeigte eine gute Übereinstimmung zwischen unseren räumlichen ATAC/CUT&Tag- und scATAC-seq/scCUT&Tag-Daten. Für ATAC-Daten wurde die Funktion FindTransferAnchors verwendet, um Übertragungsanker zu finden, die dann verwendet wurden, um scATAC-seq mit der Funktion „MapQuery“ auf unsere räumlichen ATAC-Daten abzubilden.

ArchR v.1.0.1 wurde zur Identifizierung des Zelltyps für unsere ATAC/CUT&Tag-Daten aus scRNA-seq-Daten verwendet. Die Gen-Score-Matrix unseres ATAC/CUT&Tag wurde mit der Genexpressionsmatrix von scRNA-seq verglichen und Pixel aus unseren ATAC/CUT&Tag-Daten mit Zellen aus scRNA-seq abgeglichen. Die Funktion „GeneIntegrationMatrix“ wurde verwendet, um Pseudo-scRNA-seq-Profile und Zellidentitäten hinzuzufügen.

Für verschiedene Geweberegionen wurde eine Korrelationsanalyse durchgeführt. Die Gehirnhälfte der Maus wurde gemäß RNA-Clustern und anatomischer Annotation in sieben Cluster (Corpus callosum, Striatum, oberflächliche Kortikalisschicht, tiefere Kortikalisschicht, lateraler Ventrikel, lateraler Septumkern und andere) unterteilt und als „Gewebecluster“ bezeichnet. Für Abb. 4a – c wurde die Funktion „FindMarkers“ (Einstellungen: min.pct = 0,25, logfc.threshold = 0,25) zur Berechnung unserer RNA-Daten verwendet und Gene mit angepasstem P <10−5 als Markergene ausgewählt. Die Funktion getMarkerFeatures (Einstellungen: groupBy = „tissue_clusters“) wurde angewendet, um den GAS oder CSS von Genen aus der Marker-Genliste zu berechnen (cutOff = „FDR <= 0,05“ & (cutOff = „Log2FC >= 0,1“ oder cutOff = „ Log2FC <= −0,1"). Wenn avg_log2FC > 0 (RNA) und Log2FC > 0 (CUT&Tag) für ein bestimmtes Gen, wurde es im Quadranten I angezeigt. Die GO-Anreicherungsanalyse wurde mit der Funktion „enrichGO“ (qvalueCutoff = 0,05) im ClusterProfiler v.4.2-Paket25 durchgeführt.

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Die in diesem Dokument aufgeführten rohen und verarbeiteten Daten sind im Gene Expression Omnibus mit dem Zugangscode GSE205055 hinterlegt. Diese Datensätze sind als Webressourcen verfügbar und können innerhalb der räumlichen Gewebekoordinaten im UCSC Cell and Genome Browser (https://brain-spatial-omics.cells.ucsc.edu) und in unserem eigenen, mit AtlasXplore generierten Datenportal durchsucht werden (https://web.atlasxomics.com/visualization/Fan). Daten sind auch unter https://ki.se/en/mbb/oligointernode verfügbar. Die resultierenden Fastq-Dateien wurden entweder mit dem menschlichen Referenzgenom (GRCh38) (https://hgdownload.soe.ucsc.edu/goldenPath/hg38/chromosomes/) oder dem Maus-Referenzgenom (GRCm38) (https://hgdownload.soe) abgeglichen .ucsc.edu/goldenPath/mm10/chromosomes/). Veröffentlichte Daten für Integration und Qualitätsvergleich sind online verfügbar: ENCODE ATAC-seq (E13.5 Mausembryo) (https://www.encodeproject.org/search/?type=Experiment&status=released&lated_series.@type=OrganismDevelopmentSeries&replicates.library.biosample .organism.scientific_name=Mus+musculus&assay_title=ATAC-seq&life_stage_age=embryonal%2013.5%20days); ENCODE RNA-seq (E13.5 Mausembryo): Vorderhirn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78493); Mittelhirn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78456); Hinterhirn (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE78481); Maus-Organogenese-Zellatlas (https://oncoscape.v3.sttrcancer.org/atlas.gs.washington.edu.mouse.rna/downloads); Atlas der genregulatorischen Elemente im Großhirn erwachsener Mäuse (http://catlas.org/mousebrain/#!/downloads); Atlas des Gehirns jugendlicher Mäuse (http://mousebrain.org/adolescent/downloads.html); Maushirn-scCUT&Tag-H3K27ac-Daten (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM5949207); Mausgehirn scCUT&Tag H3K27me3-Daten (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSM5949205); Mausgehirn scCUT&Tag H3K4me3-Daten (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE163532); menschlicher Hippocampus (snRNA-seq) (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE186538; und menschlicher Hippocampus (scATAC-seq) (https://www.ncbi .nlm.nih.gov/geo/query/a cc.cgi?acc=GSE147672). Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Code für die Sequenzierungsdatenanalyse ist auf Github (https://github.com/di-0579/Spatial_epigenome-transcriptome_co-sequencing) verfügbar und bei Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.7395313) archiviert.

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Wir danken dem Yale Center for Research Computing für die Beratung und Nutzung der Forschungs-Computing-Infrastruktur. Die Formen für mikrofluidische Geräte wurden am Nanofabrication Center der Yale University School of Engineering and Applied Science hergestellt. NGS wurde am Yale Center for Genome Analysis und an der Yale Stem Cell Center Genomics Core Facility durchgeführt und vom Connecticut Regenerative Medicine Research Fund und der Li Ka Shing Foundation unterstützt. Es wurde der Dienst des Genomics Core des Yale Cooperative Centre of Excellence in Hematology (Nr. U54DK106857) genutzt. Wir danken T. Jimenez-Beristain für das Verfassen von Genehmigungen zur Labortierethik und der Unterstützung bei Tierversuchen sowie den Mitarbeitern von Comparative Medicine-Biomedicum. M. Bartosovic wurde durch das Vinnova Seal of Excellence Marie-Sklodowska Curie Actions gefördert und gewährt einen RNA-zentrierten Blick auf die Entwicklung der Oligodendrozytenlinie (RODent). EA wurde von der Europäischen Union, Horizon 2020, Marie-Sklodowska Curie Actions und dem Zuschuss SOLO (Nr. 794689) gefördert. Die Arbeit in der Forschungsgruppe von GC-B. wurde vom Schwedischen Forschungsrat (Fördernummer 2019-01360), der Schwedischen Krebsgesellschaft (Cancerfonden, Nr. 190394 Pj) und der Knut and Alice Wallenberg Foundation (Fördernummer 2019) unterstützt -0107 und 2019-0089), der Schwedischen Gesellschaft für medizinische Forschung (Förderungsnr. JUB2019), der Göran Gustafsson Foundation for Research in Natural Sciences and Medicine, dem Ming Wai Lau Center for Reparative Medicine und dem Karolinska Institutet. Diese Forschung wurde vom Packard Fellowship for Science and Engineering (an RF), dem Yale Stem Cell Center Chen Innovation Award (an RF) und den US National Institutes of Health (Nr. RF1MH128876, U54AG076043, U54AG079759, UG3CA257393, UH3CA257393, R01CA245313 und U54CA274509) unterstützt nach RF). YL wurde von der Society for ImmunoTherapy of Cancer Fellowship unterstützt.

Open-Access-Förderung durch das Karolinska-Institut.

Yanxiang Deng

Aktuelle Adresse: Abteilung für Pathologie und Labormedizin, Epigenetics Institute, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania, Philadelphia, PA, USA

Diese Autoren haben gleichermaßen beigetragen: Di Zhang, Yanxiang Deng

Abteilung für Biomedizintechnik, Yale University, New Haven, CT, USA

Di Zhang, Yanxiang Deng, Graham Su, Shuozhen Bao, Yang Liu und Rong Fan

Yale Stem Cell Center und Yale Cancer Center, Yale School of Medicine, New Haven, CT, USA

Yanxiang Deng, Graham Su, Yang Liu und Rong Fan

Labor für molekulare Neurobiologie, Abteilung für medizinische Biochemie und Biophysik, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden

Petra Kukanja, Eneritz Agirre, Marek Bartosovic und Gonçalo Castelo-Branco

Abteilung für Pathologie, Yale University School of Medicine, New Haven, CT, USA

Mingze Dong, Yuval Kluger & Rong Fan

Abteilungsübergreifendes Programm für Computerbiologie und Bioinformatik, Yale University, New Haven, CT, USA

Mingze Dong & Yuval Kluger

Institut für Informatik, Princeton University, Princeton, NJ, USA

Cong Ma & Benjamin J. Raphael

Klarman Cell Observatory, Broad Institute of MIT und Harvard, Cambridge, MA, USA

Sai Ma

Abteilung für Biomedizintechnik, Columbia University, New York, NY, USA

Yang Xiao & Kam W. Leong

Abteilung für Psychiatrie, Columbia University, New York, NY, USA

Gorazd B. Rosoklija, Andrew J. Dwork, J. John Mann und Maura Boldrini

Abteilung für molekulare Bildgebung und Neuropathologie, New York State Psychiatric Institute, New York, NY, USA

Gorazd B. Rosoklija, Andrew J. Dwork, J. John Mann und Maura Boldrini

Mazedonische Akademie der Wissenschaften und Künste, Skopje, Republik Mazedonien

Gorazd B. Rosoklija und Andrew J. Dwork

Abteilung für Pathologie und Zellbiologie, Columbia University, New York, NY, USA

Andrew J. Dwork

Abteilung für Radiologie, Columbia University, New York, NY, USA

J. John Mann

Abteilung für Systembiologie, Columbia University Irving Medical Center, New York, NY, USA

Kam W. Leong

AtlasXomics, Inc., New Haven, CT, USA

Liya Wang

Genomics Institute, University of California Santa Cruz, Santa Cruz, CA, USA

Maximilian Häußler

Programm für Angewandte Mathematik, Yale University, New Haven, CT, USA

Yuval Kluger

Ming Wai Lau Center for Reparative Medicine, Stockholm Node, Karolinska Institutet, Stockholm, Schweden

Gonçalo Castelo-Branco

Programm für humane und translationale Immunologie, Yale School of Medicine, New Haven, CT, USA

Rong Fan

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RF hat die Studie konzipiert. Für die Methodik waren DZ, YD und YL verantwortlich. DZ und YD führten die experimentelle Untersuchung durch. DZ, YD, PK, EA, M. Bartosovic, MD, CM, SM, BJR, YK, GC-B. und RF waren für die Datenanalyse verantwortlich. PK, GS, SB, YX, KWL, GBR, AJD, JJM und M. Boldrini waren für die Ressourcenbeschaffung verantwortlich. LW und MH waren für den Datenbrowser verantwortlich. DZ, YD und RF haben den ursprünglichen Entwurf geschrieben. Alle Autoren haben das Manuskript überprüft, bearbeitet und genehmigt.

Korrespondenz mit Yanxiang Deng, Gonçalo Castelo-Branco oder Rong Fan.

RF, DZ und YD sind Erfinder einer vorläufigen Patentoffenlegung im Zusammenhang mit dieser Arbeit. RF ist wissenschaftlicher Gründer und Berater von IsoPlexis, Singleron Biotechnologies und AtlasXomics. Die Interessen von RF wurden vom Büro des Yale University Provost im Einklang mit den Interessenkonfliktrichtlinien der Universität geprüft und verwaltet. Die übrigen Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Nature dankt Steven Henikoff, Erica Scott und den anderen, anonymen Gutachtern für ihren Beitrag zum Peer-Review dieser Arbeit. Peer-Reviewer-Berichte sind verfügbar.

Anmerkung des Herausgebers Springer Nature bleibt hinsichtlich der Zuständigkeitsansprüche in veröffentlichten Karten und institutionellen Zugehörigkeiten neutral.

a, Schematischer Arbeitsablauf von Spatial-ATAC-RNA-Seq und Spatial-CUT&Tag-RNA-Seq. b–c, Chemie-Workflow von ATAC (b) und RNA (c) in der räumlichen ATAC-RNA-Seq. d–e, Chemie-Workflow von CUT&Tag (d) und RNA (e) in räumlicher CUT&Tag-RNA-Sequenz.

a, H&E-Bild aus einem angrenzenden Gewebeabschnitt des E13-Mausembryos. b, Räumliche Kartierung von GAS und Genexpression für ausgewählte Markergene in der räumlichen ATAC-RNA-Sequenz. c, Integration von scRNA-seq-Daten12 aus E13.5-Mausembryonen mit ATAC- und RNA-Daten in räumliche ATAC-RNA-seq. MOCA, Maus-Organogenese-Zellatlas. d, Räumliche Kartierung von Zelltypen, die durch Markierungstransfer von scRNA-seq12 auf ATAC (oben) und RNA (unten) identifiziert wurden. e, Visualisierung der Genomspur von Markergenen mit Peak-zu-Gen-Verbindungen für distale regulatorische Elemente und Peak-Co-Zugänglichkeit. f, Das Expressionsniveau und der Prozentsatz der Pixel in allen Clustern (Markergene für jeden Cluster) für RNA-Daten in räumlicher ATAC-RNA-Sequenz. g, Punktdiagramm, das die Identifizierung positiver TF-Regulatoren zeigt. h, räumliche Zuordnung der Abweichungswerte für ausgewählte TF-Motive. i, Annotation von Markerpeaks in verschiedenen Clustern. j, GROSSARTIGE Anreicherungsanalyse von Markerpeaks in verschiedenen Clustern (binomiale und hypergeometrische Tests).

a, GO-Anreicherungsanalyse für Gene aus Abb. 1g. b,c, Pseudozeitanalyse von radialer Glia bis zu postmitotischen vorzeitigen Neuronen mit GAS (b) und Genexpression (c). d, Monocle2-Analysen zeigen verschiedene Zustände in (b). e, Heatmap verschiedener Zustände entlang der Pseudozeit-Trajektorie. f, GO-Analyse der Gene im roten Feld von (e) (Einseitige Version des exakten Fisher-Tests, p-Wert wurde für mehrere Vergleiche nach der Benjamini- und Hochberg-Methode angepasst).

a, Räumliche Kartierung von Genaktivitätswerten und Genexpression für ausgewählte Markergene in räumlicher ATAC-RNA-Seq. b: Visualisierung der Genomspur von Markergenen mit Peak-zu-Gen-Verbindungen für distale regulatorische Elemente und Peak-Co-Zugänglichkeit. c, Räumliche Kartierung von Zelltypen, die durch Etikettenübertragung von scATAC-seq30 auf ATAC-Daten identifiziert wurden. IT: intratelenzephal. PT: Pyramidenbahn. NP: nahezu projizierend. CT: kortikothalamisch. L: Schicht. d, Räumliche Kartierung von Zelltypen, die durch Markierungsübertragung von scRNA-seq32 auf RNA-Daten identifiziert wurden.

a: Kandidaten für TF-Regulatoren von Sox2, Pax6 und Mobp. Hervorgehobene Punkte sind TFs mit einem ABS-Wert (Regulation Score) ≥ 1 (−log10-Skala)33, alle anderen TFs sind grau dargestellt (Z-Test). b, Räumliche Zuordnung der Abweichungswerte für ausgewählte TF-Motive. c, Heatmaps von Peak-Gen-Verbindungen in der räumlichen ATAC-RNA-Seq. d, Die Anzahl der signifikant korrelierten Peaks für jedes Gen.

a–c, räumliche Verteilung und UMAP aller Cluster für ATAC (a), RNA (b) und gemeinsame Clusterbildung von ATAC und RNA (c) in der räumlichen ATAC-RNA-Sequenz für das Gehirn der Maus. Pixelgröße: 20 µm. Maßstabsleiste, 1 mm. d: Nissl-gefärbtes Bild von einem angrenzenden Gewebeabschnitt des Gehirns einer P21-Maus. Maßstabsleiste, 1 mm. e, Integration von ATAC-Daten in räumlicher ATAC-RNA-Seq mit scATAC-Seq-Daten30 aus dem Gehirn von Mäusen. f, Integration von RNA-Daten in räumlicher ATAC-RNA-Seq mit scRNA-Seq-Daten32 aus dem Gehirn von Mäusen. g, Räumliche Kartierung von GAS und Genexpression für ausgewählte Markergene in verschiedenen Clustern für ATAC und RNA in räumlicher ATAC-RNA-Seq.

a, Integration von CUT&Tag (H3K4me3)-Daten in die räumliche CUT&Tag-RNA-Sequenz mit scCUT&Tag (H3K4me3)-Daten36 aus dem Gehirn von Mäusen. b, Integration von RNA-Daten in räumliche CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq, räumliche CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq und räumliche CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seq mit scRNA-seq-Daten32 aus dem Gehirn von Mäusen. ce, Integration von RNA-Daten in Spatial-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq (c), RNA-Daten in Daten in Spatial-CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq (d) und RNA-Daten in Spatial-CUT&Tag(H3K4me3) -RNA-seq (e) mit scRNA-seq-Daten32 aus dem Gehirn einer Maus. f, Räumliche Kartierung von Zelltypen, die durch Markierungsübertragung von scRNA-seq32 auf RNA-Daten in räumlicher-CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-seq identifiziert wurden. g, Räumliche Kartierung von Zelltypen, die durch Markierungsübertragung von scRNA-seq32 auf RNA (oben) und von scRNA-seq32 auf CUT&Tag-Daten (H3K27ac, unten) in räumlichen CUT&Tag(H3K27ac)-RNA-seq-Daten identifiziert wurden. h, Räumliche Kartierung von Zelltypen, die durch Markierungsübertragung von scRNA-seq32 auf RNA (oben) und von scRNA-seq32 auf CUT&Tag-Daten (H3K4me3, unten) in räumlichen CUT&Tag(H3K4me3)-RNA-seq-Daten identifiziert wurden.

ac, räumliche Verteilung und UMAP aller Cluster für CUT&Tag (H3K27ac) (a), RNA (b) und gemeinsame Clusterbildung von CUT&Tag (H3K27ac) und RNA (c) in räumlicher CUT&Tag-RNA-Sequenz für das Mausgehirn. Pixelgröße: 20 µm. Maßstabsleiste, 1 mm. d: Nissl-gefärbtes Bild von einem angrenzenden Gewebeabschnitt des Gehirns einer P21-Maus. Maßstabsleiste, 1 mm. e, Integration von CUT&Tag (H3K27ac)-Daten in räumliche CUT&Tag-RNA-Seq mit scCUT&Tag (H3K27ac)-Daten37 aus dem Gehirn von Mäusen. f, Integration von RNA-Daten in Spatial-CUT&Tag-RNA-Seq mit scRNA-Seq-Daten32 aus dem Gehirn von Mäusen.

ag, räumliche Kartierung von CSS, GAS und Genexpression von Mal (a), Mag (b), Car2 (c), Grin2b (d), Syt1 (e), Gpr88 (f) und Ptprz1 (g) von ATAC und RNA in der räumlichen ATAC-RNA-Sequenz und CUT&Tag (H3K27me3, H3K27ac oder H3K4me3) und RNA in der räumlichen CUT&Tag-RNA-Sequenz. h, Räumliche Kartierung von CSS und Genexpression von Nav3, Sncb, Ablim2 und Gng7 in der räumlichen CUT&Tag(H3K27me3)-RNA-Sequenz.

a, Räumliche Kartierung von Zelltypen, die durch Markierungstransfer von scRNA-seq43 auf RNA-Daten in räumlicher ATAC-RNA-seq für den menschlichen Hippocampus identifiziert wurden. b, Punktdiagramm, das die Identifizierung positiver TF-Regulatoren zeigt. c, Räumliche Kartierung von Abweichungswerten für ausgewählte TF-Motive in der räumlichen ATAC-RNA-Sequenz.

Ergänzende Abbildungen. 1–14, Tabellen 2–7 und Statistiken und Reproduzierbarkeit.

Eine Liste von Zelltypanmerkungen im Gehirn von Mäusen.

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Nachdrucke und Genehmigungen

Zhang, D., Deng, Y., Kukanja, P. et al. Räumliches Epigenom-Transkriptom-Co-Profiling von Säugetiergeweben. Natur 616, 113–122 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1

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Eingegangen: 06. Juni 2022

Angenommen: 03. Februar 2023

Veröffentlicht: 15. März 2023

Ausgabedatum: 06. April 2023

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-023-05795-1

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